सेंट जॉन्स वॉर्टमधील इन विट्रो ऑर्गनोजेनेसिस आणि बायोएक्टिव्ह संयुगांच्या उत्पादनावर वनस्पती वाढीच्या नियामकांचा आणि आयर्न ऑक्साईड नॅनोपार्टिकल्सचा सहक्रियात्मक परिणाम.

या अभ्यासात, एकत्रित उपचारांचे उत्तेजक परिणामवनस्पती वाढ नियंत्रक*हायपरिकम परफोरेटम* एल. मधील इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस आणि दुय्यम मेटाबोलाइट उत्पादनावर (२,४-डी आणि किनेटिन) आणि आयर्न ऑक्साईड नॅनोपार्टिकल्स (Fe₃O₄-NPs) चा अभ्यास करण्यात आला. ऑप्टिमाइज्ड ट्रीटमेंट [२,४-डी (०.५ मिग्रॅ/लिटर) + किनेटिन (२ मिग्रॅ/लिटर) + Fe₃O₄-NPs (४ मिग्रॅ/लिटर)] ने वनस्पतींच्या वाढीच्या पॅरामीटर्समध्ये लक्षणीय सुधारणा केली: नियंत्रण गटाच्या तुलनेत वनस्पतीची उंची ५९.६%, मुळांची लांबी ११४.०%, कळ्यांची संख्या १८०.०% आणि कॅलस फ्रेश वेट १९८.३% ने वाढली. या एकत्रित ट्रीटमेंटमुळे पुनर्जन्म कार्यक्षमता (५०.८५%) वाढली आणि हायपरिसिनचे प्रमाण ६६.६% ने वाढले. GC-MS विश्लेषणात हायपरोसाइड, β-पॅथोलीन आणि सेटाइल अल्कोहोलचे प्रमाण जास्त असल्याचे आढळून आले, जे एकूण पीक क्षेत्राच्या 93.36% आहे, तर एकूण फिनोलिक्स आणि फ्लेव्होनॉइड्सचे प्रमाण 80.1% पर्यंत वाढले आहे. हे निकाल दर्शवितात की वनस्पती वाढ नियामक (PGRs) आणि Fe₃O₄ नॅनोपार्टिकल्स (Fe₃O₄-NPs) ऑर्गनोजेनेसिसला उत्तेजन देऊन आणि बायोएक्टिव्ह संयुगे जमा करून एक सहक्रियात्मक प्रभाव पाडतात, जे औषधी वनस्पतींच्या जैवतंत्रज्ञान सुधारणेसाठी एक आशादायक धोरण दर्शवते.
सेंट जॉन्स वॉर्ट (हायपरिकम परफोरेटम एल.), ज्याला सेंट जॉन्स वॉर्ट असेही म्हणतात, हा हायपरिकेसी कुटुंबातील एक बारमाही औषधी वनस्पती आहे ज्याचे आर्थिक मूल्य आहे.[1] त्याच्या संभाव्य जैविक सक्रिय घटकांमध्ये नैसर्गिक टॅनिन, झेंथोन्स, फ्लोरोग्लुसिनॉल, नॅप्थालेनेडियनथ्रोन (हायपरिन आणि स्यूडोहायपरिन), फ्लेव्होनॉइड्स, फेनोलिक अॅसिड आणि आवश्यक तेले यांचा समावेश आहे.[2,3,4] सेंट जॉन्स वॉर्टचा प्रसार पारंपारिक पद्धतींनी करता येतो; तथापि, पारंपारिक पद्धतींची ऋतूमानता, कमी बियाणे उगवण आणि रोगांना संवेदनशीलता यामुळे मोठ्या प्रमाणात लागवड आणि दुय्यम चयापचयांची सतत निर्मिती होण्याची त्याची क्षमता मर्यादित होते.[1,5,6]
अशाप्रकारे, इन विट्रो टिश्यू कल्चर ही वनस्पतींच्या जलद प्रसारासाठी, जर्मप्लाझम संसाधनांचे संवर्धन करण्यासाठी आणि औषधी संयुगांच्या उत्पादनात वाढ करण्यासाठी एक प्रभावी पद्धत मानली जाते [7, 8]. वनस्पती वाढ नियामक (PGRs) मॉर्फोजेनेसिसचे नियमन करण्यात महत्त्वपूर्ण भूमिका बजावतात आणि कॅलस आणि संपूर्ण जीवांच्या इन विट्रो लागवडीसाठी आवश्यक आहेत. या विकासात्मक प्रक्रिया यशस्वीरित्या पूर्ण करण्यासाठी त्यांच्या सांद्रता आणि संयोजनांचे ऑप्टिमायझेशन महत्त्वपूर्ण आहे [9]. म्हणून, सेंट जॉन्स वॉर्ट (एच. परफोरेटम) [10] ची वाढ आणि पुनरुत्पादन क्षमता सुधारण्यासाठी नियामकांची योग्य रचना आणि एकाग्रता समजून घेणे महत्वाचे आहे.
आयर्न ऑक्साईड नॅनोपार्टिकल्स (Fe₃O₄) हे नॅनोपार्टिकल्सचे एक वर्ग आहे जे टिश्यू कल्चरसाठी विकसित केले गेले आहेत किंवा विकसित केले जात आहेत. Fe₃O₄ मध्ये लक्षणीय चुंबकीय गुणधर्म, चांगली जैव सुसंगतता आणि वनस्पतींच्या वाढीस चालना देण्याची आणि पर्यावरणीय ताण कमी करण्याची क्षमता आहे, म्हणूनच टिश्यू कल्चर डिझाइनमध्ये याने बरेच लक्ष वेधले आहे. या नॅनोपार्टिकल्सच्या संभाव्य अनुप्रयोगांमध्ये पेशी विभाजनाला चालना देण्यासाठी इन विट्रो कल्चर ऑप्टिमायझेशन, पोषक तत्वांचे शोषण सुधारणे आणि अँटिऑक्सिडंट एन्झाईम्स सक्रिय करणे समाविष्ट असू शकते [11].
जरी नॅनोपार्टिकल्सने वनस्पतींच्या वाढीवर चांगले प्रोत्साहन देणारे परिणाम दाखवले असले तरी, *H. perforatum* मध्ये Fe₃O₄ नॅनोपार्टिकल्स आणि ऑप्टिमाइज्ड वनस्पती वाढ नियामकांच्या एकत्रित वापरावरील अभ्यास दुर्मिळ आहेत. ही ज्ञानाची कमतरता भरून काढण्यासाठी, या अभ्यासात औषधी वनस्पतींची वैशिष्ट्ये सुधारण्यासाठी नवीन अंतर्दृष्टी प्रदान करण्यासाठी इन विट्रो मॉर्फोजेनेसिस आणि दुय्यम मेटाबोलाइट उत्पादनावरील त्यांच्या एकत्रित परिणामांचे मूल्यांकन केले गेले. म्हणून, या अभ्यासाचे दोन उद्दिष्टे आहेत: (१) कॅलस निर्मिती, अंकुर पुनर्जन्म आणि इन विट्रोमध्ये मुळे प्रभावीपणे वाढविण्यासाठी वनस्पती वाढ नियामकांच्या एकाग्रतेचे ऑप्टिमाइझ करणे; आणि (२) इन विट्रोमध्ये वाढीच्या पॅरामीटर्सवर Fe₃O₄ नॅनोपार्टिकल्सच्या प्रभावांचे मूल्यांकन करणे. भविष्यातील योजनांमध्ये अनुकूलन (इन विट्रो) दरम्यान पुनर्जन्मित वनस्पतींच्या जगण्याच्या दराचे मूल्यांकन करणे समाविष्ट आहे. अशी अपेक्षा आहे की या अभ्यासाचे निकाल *H. perforatum* च्या सूक्ष्मप्रसार कार्यक्षमतेत लक्षणीय सुधारणा करतील, ज्यामुळे या महत्त्वाच्या औषधी वनस्पतीचा शाश्वत वापर आणि जैवतंत्रज्ञान अनुप्रयोगांमध्ये योगदान मिळेल.
या अभ्यासात, आम्हाला शेतात उगवलेल्या वार्षिक सेंट जॉन्स वॉर्ट वनस्पतींपासून (मातृ वनस्पती) पानांचे एक्सप्लांट मिळाले. या एक्सप्लांटचा वापर इन विट्रो कल्चर परिस्थिती अनुकूल करण्यासाठी केला गेला. कल्चरिंग करण्यापूर्वी, पाने काही मिनिटांसाठी वाहत्या डिस्टिल्ड पाण्याखाली पूर्णपणे धुतली गेली. नंतर एक्सप्लांट पृष्ठभाग 30 सेकंदांसाठी 70% इथेनॉलमध्ये बुडवून निर्जंतुक केले गेले, त्यानंतर 1.5% सोडियम हायपोक्लोराइट (NaOCl) द्रावणात ट्वीन 20 चे काही थेंब असलेल्या 10 मिनिटांसाठी बुडवले गेले. शेवटी, पुढील कल्चर माध्यमात स्थानांतरित करण्यापूर्वी एक्सप्लांट तीन वेळा निर्जंतुक डिस्टिल्ड पाण्याने धुतले गेले.
पुढील चार आठवड्यांमध्ये, अंकुर पुनर्जन्म मापदंड मोजले गेले, ज्यामध्ये पुनर्जन्म दर, प्रति अंकुर संख्या आणि अंकुर लांबी यांचा समावेश होता. जेव्हा पुनर्जन्मित अंकुरांची लांबी किमान 2 सेमी पर्यंत पोहोचली, तेव्हा त्यांना अर्ध-शक्ती एमएस माध्यम, 0.5 मिलीग्राम/लिटर इंडोलेब्युटीरिक अॅसिड (IBA) आणि 0.3% ग्वार गम असलेल्या रूटिंग माध्यमात स्थानांतरित केले गेले. रूटिंग कल्चर तीन आठवडे चालू राहिले, त्या दरम्यान रूटिंग रेट, मुळांची संख्या आणि मुळांची लांबी मोजली गेली. प्रत्येक उपचार तीन वेळा पुनरावृत्ती करण्यात आला, प्रत्येक प्रतिकृतीसाठी 10 एक्सप्लांट कल्चर केले गेले, ज्यामुळे प्रत्येक उपचारासाठी अंदाजे 30 एक्सप्लांट मिळाले.
रोपाच्या पायथ्यापासून सर्वात उंच पानाच्या टोकापर्यंत रुलर वापरून रोपांची उंची सेंटीमीटर (सेमी) मध्ये मोजली गेली. रोपे काळजीपूर्वक काढून टाकल्यानंतर आणि वाढणारे माध्यम काढून टाकल्यानंतर लगेचच मुळांची लांबी मिलिमीटर (मिमी) मध्ये मोजली गेली. प्रत्येक रोपावर प्रत्येक अंकुरांची संख्या थेट मोजली गेली. पानांवरील काळ्या डागांची संख्या, ज्याला नोड्यूल म्हणतात, दृश्यमानपणे मोजली गेली. हे काळे गाठी हायपरिसिन किंवा ऑक्सिडेटिव्ह डाग असलेल्या ग्रंथी असल्याचे मानले जाते आणि उपचारांना वनस्पतीच्या प्रतिसादाचे शारीरिक सूचक म्हणून वापरले जातात. सर्व वाढणारे माध्यम काढून टाकल्यानंतर, रोपांचे ताजे वजन मिलिग्राम (मिग्रॅ) च्या अचूकतेसह इलेक्ट्रॉनिक स्केल वापरून मोजले गेले.
कॅलस निर्मितीचा दर मोजण्याची पद्धत खालीलप्रमाणे आहे: विविध वाढ नियामक (किनासेस, 2,4-D, आणि Fe3O4) असलेल्या माध्यमात चार आठवडे एक्सप्लांट्सचे संवर्धन केल्यानंतर, कॅलस तयार करण्यास सक्षम असलेल्या एक्सप्लांट्सची संख्या मोजली जाते. कॅलस निर्मितीचा दर मोजण्याचे सूत्र खालीलप्रमाणे आहे:
प्रत्येक उपचार तीन वेळा पुनरावृत्ती करण्यात आला, प्रत्येक पुनरावृत्तीमध्ये किमान १० एक्सप्लांट्स तपासण्यात आले.
पुनर्जन्म दर कॅलस टिश्यूचे प्रमाण प्रतिबिंबित करतो जे कॅलस निर्मितीच्या अवस्थेनंतर कळी भिन्नता प्रक्रिया यशस्वीरित्या पूर्ण करतात. हे सूचक कॅलस टिश्यूचे विभेदित ऊतींमध्ये रूपांतर करण्याची आणि नवीन वनस्पती अवयवांमध्ये वाढण्याची क्षमता दर्शवते.
मुळांच्या वाढीचा गुणांक म्हणजे मुळांच्या वाढीस सक्षम असलेल्या फांद्यांच्या संख्येचे एकूण फांद्यांच्या संख्येशी गुणोत्तर. हे सूचक मुळांच्या वाढीच्या अवस्थेचे यश दर्शवते, जे सूक्ष्म प्रसार आणि वनस्पतींच्या प्रसारात महत्त्वपूर्ण आहे, कारण चांगले मुळांमुळे रोपे वाढत्या परिस्थितीत चांगले टिकून राहण्यास मदत होते.
९०% मिथेनॉल वापरून हायपरिसिन संयुगे काढली गेली. १ मिली मिथेनॉलमध्ये पन्नास मिलीग्राम वाळलेल्या वनस्पतींचे साहित्य जोडले गेले आणि अंधारात खोलीच्या तपमानावर अल्ट्रासोनिक क्लिनर (मॉडेल A5120-3YJ) मध्ये ३० kHz वर २० मिनिटांसाठी सोनिकेट केले गेले. सोनिकेशननंतर, नमुना १५ मिनिटांसाठी ६००० आरपीएमवर सेंट्रीफ्यूज केला गेला. सुपरनॅटंट गोळा करण्यात आला आणि कॉन्सेइकाओ आणि इतरांनी वर्णन केलेल्या पद्धतीनुसार प्लस-३००० एस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर वापरून हायपरिसिनचे शोषण ५९२ एनएम मोजले गेले. [14].
वनस्पतींच्या वाढीचे नियामक (PGRs) आणि आयर्न ऑक्साईड नॅनोपार्टिकल्स (Fe₃O₄-NPs) वापरून केलेल्या बहुतेक उपचारांमुळे पुनर्जन्मित कोंबांच्या पानांवर काळे गाठी तयार झाल्या नाहीत. ०.५ किंवा १ mg/L २,४-D, ०.५ किंवा १ mg/L किनेटिन, किंवा १, २, किंवा ४ mg/L आयर्न ऑक्साईड नॅनोपार्टिकल्स असलेल्या कोणत्याही उपचारांमध्ये कोणतेही गाठी आढळल्या नाहीत. काही संयोजनांनी किनेटिन आणि/किंवा आयर्न ऑक्साईड नॅनोपार्टिकल्सच्या उच्च सांद्रतेवर गाठींच्या विकासात थोडीशी वाढ दर्शविली (परंतु सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण नाही), जसे की २,४-D (०.५-२ mg/L) आणि किनेटिन (१-१.५ mg/L) आणि आयर्न ऑक्साईड नॅनोपार्टिकल्स (२-४ mg/L) यांचे संयोजन. हे परिणाम आकृती २ मध्ये दर्शविले आहेत. काळे गाठी हायपरिसिन-समृद्ध ग्रंथी दर्शवितात, नैसर्गिकरित्या उद्भवणाऱ्या आणि फायदेशीर दोन्ही. या अभ्यासात, काळे गाठी प्रामुख्याने ऊतींच्या तपकिरी होण्याशी संबंधित होते, जे हायपरिसिन संचयनासाठी अनुकूल वातावरण दर्शवते. २,४-डी, किनेटिन आणि Fe₃O₄ नॅनोपार्टिकल्सच्या उपचारांमुळे कॅलसची वाढ, तपकिरीपणा कमी आणि क्लोरोफिल सामग्री वाढली, ज्यामुळे चयापचय कार्य सुधारले आणि ऑक्सिडेटिव्ह नुकसानाची संभाव्य घट सूचित झाली [३७]. या अभ्यासात सेंट जॉन्स वॉर्ट कॅलसच्या वाढीवर आणि विकासावर २,४-डी आणि Fe₃O₄ नॅनोपार्टिकल्सच्या संयोजनात किनेटिनच्या परिणामांचे मूल्यांकन केले गेले (आकृती ३अ-जी). मागील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की Fe₃O₄ नॅनोपार्टिकल्समध्ये अँटीफंगल आणि अँटीमायक्रोबियल क्रियाकलाप असतात [३८, ३९] आणि जेव्हा वनस्पती वाढीच्या नियामकांसह वापरले जातात तेव्हा ते वनस्पती संरक्षण यंत्रणांना उत्तेजन देऊ शकतात आणि सेल्युलर ताण निर्देशांक कमी करू शकतात [१८]. दुय्यम चयापचयांचे जैवसंश्लेषण अनुवांशिकरित्या नियंत्रित केले जात असले तरी, त्यांचे वास्तविक उत्पादन पर्यावरणीय परिस्थितीवर खूप अवलंबून असते. चयापचय आणि आकारिकीय बदल विशिष्ट वनस्पती जनुकांच्या अभिव्यक्तीचे नियमन करून आणि पर्यावरणीय घटकांना प्रतिसाद देऊन दुय्यम चयापचय पातळीवर प्रभाव टाकू शकतात. शिवाय, इंड्युसर नवीन जनुकांच्या सक्रियतेला चालना देऊ शकतात, ज्यामुळे एंजाइमॅटिक क्रियाकलाप उत्तेजित होतात, शेवटी अनेक बायोसिंथेटिक मार्ग सक्रिय होतात आणि दुय्यम चयापचय तयार होतात. शिवाय, दुसऱ्या अभ्यासात असे दिसून आले आहे की सावली कमी केल्याने सूर्यप्रकाशाचा संपर्क वाढतो, ज्यामुळे *हायपरिकम परफोरेटम* च्या नैसर्गिक अधिवासात दिवसाचे तापमान वाढते, जे हायपरिसिन उत्पादन वाढविण्यास देखील योगदान देते. या डेटाच्या आधारे, या अभ्यासात ऊती संवर्धनात संभाव्य प्रेरक म्हणून लोह नॅनोपार्टिकल्सची भूमिका तपासली गेली. निकालांवरून असे दिसून आले की हे नॅनोपार्टिकल्स एंजाइमॅटिक उत्तेजनाद्वारे हेस्पेरिडिन बायोसिंथेसिसमध्ये सहभागी असलेल्या जनुकांना सक्रिय करू शकतात, ज्यामुळे या संयुगाचे संचय वाढते (आकृती 2). म्हणून, नैसर्गिक परिस्थितीत वाढणाऱ्या वनस्पतींच्या तुलनेत, असा युक्तिवाद केला जाऊ शकतो की जेव्हा मध्यम ताण दुय्यम चयापचयांच्या जैवसंश्लेषणात सहभागी असलेल्या जनुकांच्या सक्रियतेसह एकत्रित केला जातो तेव्हा अशा संयुगांचे उत्पादन देखील वाढवता येते. संयोजन उपचारांचा सामान्यतः पुनर्जन्म दरावर सकारात्मक परिणाम होतो, परंतु काही प्रकरणांमध्ये, हा परिणाम कमकुवत होतो. विशेषतः, १ मिलीग्राम/लिटर २,४-डी, १.५ मिलीग्राम/लिटर काइनेज आणि वेगवेगळ्या सांद्रतांनी उपचार केल्याने नियंत्रण गटाच्या तुलनेत पुनर्जन्म दर स्वतंत्रपणे आणि लक्षणीयरीत्या ५०.८५% वाढू शकतो (आकृती ४क). हे निकाल सूचित करतात की नॅनोहार्मोन्सचे विशिष्ट संयोजन वनस्पतींच्या वाढीस आणि मेटाबोलाइट उत्पादनास चालना देण्यासाठी सहक्रियात्मकपणे कार्य करू शकतात, जे औषधी वनस्पतींच्या ऊतींच्या संवर्धनासाठी खूप महत्वाचे आहे. पामर आणि केलर [५०] ने दाखवले की २,४-डी उपचार स्वतंत्रपणे सेंट परफोरेटममध्ये कॉलस निर्मितीस प्रवृत्त करू शकतात, तर काइनेज जोडल्याने कॉलस निर्मिती आणि पुनरुत्पादन लक्षणीयरीत्या वाढले. हा परिणाम हार्मोनल संतुलन सुधारणे आणि पेशी विभाजनाच्या उत्तेजनामुळे झाला. बाल आणि इतर [५१] ला आढळले की Fe₃O₄-NP उपचार स्वतंत्रपणे अँटिऑक्सिडंट एंजाइमचे कार्य वाढवू शकतात, ज्यामुळे सेंट परफोरेटममध्ये मुळांची वाढ होते. ०.५ मिलीग्राम/लिटर, १ मिलीग्राम/लिटर आणि १.५ मिलीग्राम/लिटरच्या सांद्रतेवर Fe₃O₄ नॅनोपार्टिकल्स असलेल्या कल्चर मीडियाने अंबाडीच्या वनस्पतींचा पुनर्जन्म दर सुधारला [५२]. किनेटिन, २,४-डायक्लोरोबेंझोथियाझोलिनोन आणि फे₃ओ₄ नॅनोपार्टिकल्सच्या वापरामुळे कॅलस आणि मुळांच्या निर्मिती दरात लक्षणीय सुधारणा झाली, तथापि, इन विट्रो पुनर्जन्मसाठी या संप्रेरकांचा वापर करण्याचे संभाव्य दुष्परिणाम विचारात घेणे आवश्यक आहे. उदाहरणार्थ, २,४-डायक्लोरोबेंझोथियाझोलिनोन किंवा किनेटिनचा दीर्घकालीन किंवा उच्च-सांद्रता वापरल्याने सोमॅटिक क्लोनल भिन्नता, ऑक्सिडेटिव्ह ताण, असामान्य कॅलस आकारविज्ञान किंवा विट्रिफिकेशन होऊ शकते. म्हणून, उच्च पुनर्जन्म दर अनुवांशिक स्थिरतेचा अंदाज लावत नाही. सर्व पुनर्जन्मित वनस्पतींचे मूल्यांकन आण्विक मार्कर (उदा. RAPD, ISSR, AFLP) किंवा सायटोजेनेटिक विश्लेषण वापरून केले पाहिजे जेणेकरून त्यांची एकरूपता आणि इन व्हिव्हो वनस्पतींशी समानता निश्चित होईल [53,54,55].
या अभ्यासातून पहिल्यांदाच असे दिसून आले की वनस्पतींच्या वाढीच्या नियामकांचा (२,४-डी आणि किनेटिन) Fe₃O₄ नॅनोपार्टिकल्ससह एकत्रित वापर केल्याने *हायपरिकम परफोरेटम* मध्ये मॉर्फोजेनेसिस आणि प्रमुख जैवक्रिय चयापचयांचे (हायपरिसिन आणि हायपरोसाइडसह) संचय वाढू शकतो. ऑप्टिमाइझ्ड उपचार पद्धती (१ मिग्रॅ/लिटर २,४-डी + १ मिग्रॅ/लिटर किनेटिन + ४ मिग्रॅ/लिटर Fe₃O₄-NPs) केवळ कॅलस निर्मिती, ऑर्गनोजेनेसिस आणि दुय्यम मेटाबोलाइट उत्पन्न वाढवत नाही तर सौम्य प्रेरक प्रभाव देखील दर्शविते, ज्यामुळे वनस्पतीची ताण सहनशीलता आणि औषधी मूल्य सुधारते. नॅनोटेक्नॉलॉजी आणि वनस्पती ऊती संवर्धनाचे संयोजन औषधी संयुगांच्या मोठ्या प्रमाणात इन विट्रो उत्पादनासाठी एक शाश्वत आणि कार्यक्षम व्यासपीठ प्रदान करते. हे निकाल औद्योगिक अनुप्रयोग आणि आण्विक यंत्रणा, डोस ऑप्टिमायझेशन आणि अनुवांशिक अचूकतेमध्ये भविष्यातील संशोधनाचा मार्ग मोकळा करतात, ज्यामुळे औषधी वनस्पतींवरील मूलभूत संशोधन व्यावहारिक जैवतंत्रज्ञानाशी जोडले जाते.