एडीस इजिप्टी (डिप्टेरा: क्युलीसिडी) या डासाच्या अळी आणि प्रौढ कीटकांवरील उपाय म्हणून वनस्पतींच्या सुगंधी तेलांवर आधारित टर्पीन संयुगांचे मिश्रण.

Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझरच्या आवृत्तीमध्ये CSS साठी मर्यादित सपोर्ट आहे. सर्वोत्तम परिणामांसाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही तुमच्या ब्राउझरची नवीन आवृत्ती वापरावी (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमधील कॉम्पॅटिबिलिटी मोड अक्षम करावा). यादरम्यान, सतत सपोर्ट सुरू ठेवण्यासाठी, आम्ही ही साइट स्टायलिंग किंवा जावास्क्रिप्टशिवाय दाखवत आहोत.
वनस्पतींपासून मिळवलेल्या कीटकनाशक संयुगांचे मिश्रण कीटकांविरुद्ध सहक्रियात्मक किंवा विरोधी आंतरक्रिया दर्शवू शकते. एडीस डासांमुळे पसरणाऱ्या रोगांचा झपाट्याने होणारा प्रसार आणि पारंपरिक कीटकनाशकांना एडीस डासांच्या लोकसंख्येमध्ये वाढणारा प्रतिकार लक्षात घेता, वनस्पतींच्या आवश्यक तेलांवर आधारित टर्पीन संयुगांची अठ्ठावीस मिश्रणे तयार करण्यात आली आणि एडीस इजिप्ती डासांच्या अळी व प्रौढ अवस्थांवर त्यांची चाचणी घेण्यात आली. सुरुवातीला पाच वनस्पतींच्या आवश्यक तेलांचे (EOs) त्यांच्या अळीनाशक आणि प्रौढ डासांवरील प्रभावीतेसाठी मूल्यांकन करण्यात आले आणि GC-MS परिणामांच्या आधारे प्रत्येक EO मध्ये दोन प्रमुख संयुगे ओळखण्यात आली. ओळखलेली मुख्य संयुगे, म्हणजेच डायॲलिल डायसल्फाइड, डायॲलिल ट्रायसल्फाइड, कार्व्होन, लिमोनेन, युजेनॉल, मिथाइल युजेनॉल, युकॅलिप्टोल, युडेस्मोल आणि मॉस्किटो अल्फा-पिनेन, खरेदी करण्यात आली. त्यानंतर या संयुगांची द्विसंमिश्रणे उपघातक मात्रा वापरून तयार करण्यात आली आणि त्यांचे सहक्रियात्मक व विरोधी परिणाम तपासले व निश्चित केले गेले. लिमोनेनला डायॲलिल डायसल्फाइडमध्ये मिसळून सर्वोत्तम अळीनाशक मिश्रणं मिळतात, आणि कार्वोनला लिमोनेनमध्ये मिसळून सर्वोत्तम प्रौढनाशक मिश्रणं मिळतात. व्यावसायिकरित्या वापरले जाणारे कृत्रिम अळीनाशक टेम्फॉस आणि प्रौढ कीटकांवरील औषध मॅलाथिऑन यांची स्वतंत्रपणे आणि टर्पेनॉइड्ससोबतच्या द्विमिश्रणांमध्ये चाचणी घेण्यात आली. निकालांवरून असे दिसून आले की, टेम्फॉस आणि डायॲलिल डायसल्फाइड तसेच मॅलाथिऑन आणि युडेस्मोल यांचे मिश्रण हे सर्वात प्रभावी मिश्रण होते. या शक्तिशाली मिश्रणांमध्ये एडीस इजिप्टीविरुद्ध वापरण्याची क्षमता आहे.
वनस्पतींची आवश्यक तेले (EOs) ही विविध जैवक्रियाशील संयुगे असलेली दुय्यम चयापचय उत्पादने आहेत आणि कृत्रिम कीटकनाशकांना पर्याय म्हणून त्यांचे महत्त्व वाढत आहे. ती केवळ पर्यावरणपूरक आणि वापरण्यास सोपी नाहीत, तर ती विविध जैवक्रियाशील संयुगांचे मिश्रण देखील आहेत, ज्यामुळे औषध-प्रतिकारशक्ती विकसित होण्याची शक्यता देखील कमी होते¹. GC-MS तंत्रज्ञानाचा वापर करून, संशोधकांनी विविध वनस्पतींच्या आवश्यक तेलांमधील घटकांचा अभ्यास केला आणि १७,५०० सुगंधी वनस्पतींमधून ३,००० पेक्षा जास्त संयुगे ओळखली², ज्यापैकी बहुतेकांची कीटकनाशक गुणधर्मांसाठी चाचणी केली गेली आणि त्यांच्यात कीटकनाशक प्रभाव असल्याचे नोंदवले गेले आहे³,⁴. काही अभ्यासांमधून असे दिसून येते की संयुगाच्या मुख्य घटकाची विषारीता ही त्याच्या मूळ इथिलीन ऑक्साईडच्या विषारीतेइतकीच किंवा त्याहून अधिक असते. परंतु, रासायनिक कीटकनाशकांच्या बाबतीत जसे घडते, त्याचप्रमाणे वैयक्तिक संयुगांच्या वापरामुळे पुन्हा प्रतिकारशक्ती विकसित होण्यास वाव मिळू शकतो⁵,⁶. त्यामुळे, कीटकनाशक परिणामकारकता सुधारण्यासाठी आणि लक्ष्यित कीटकांच्या समूहांमध्ये प्रतिकारशक्तीची शक्यता कमी करण्यासाठी, इथिलीन ऑक्साईड-आधारित संयुगांची मिश्रणे तयार करण्यावर सध्या लक्ष केंद्रित केले जात आहे. आवश्यक तेलांमध्ये (EOs) असलेले वैयक्तिक सक्रिय संयुगे एकत्रितपणे सहक्रियात्मक किंवा विरोधी परिणाम दर्शवू शकतात, जे त्या EO ची एकूण क्रियाशीलता दर्शवते. या वस्तुस्थितीवर पूर्वीच्या संशोधकांनी केलेल्या अभ्यासांमध्ये जोर देण्यात आला आहे⁷,⁸. कीटक नियंत्रण कार्यक्रमामध्ये EO आणि त्याच्या घटकांचाही समावेश असतो. आवश्यक तेलांच्या डासनाशक क्रियाशीलतेचा क्युलेक्स आणि ॲनोफिलीस डासांवर विस्तृतपणे अभ्यास केला गेला आहे. एकूण विषारीपणा वाढवण्यासाठी आणि दुष्परिणाम कमी करण्यासाठी, विविध वनस्पतींना व्यावसायिकरित्या वापरल्या जाणाऱ्या कृत्रिम कीटकनाशकांसोबत एकत्र करून प्रभावी कीटकनाशके विकसित करण्याचे अनेक अभ्यासांनी प्रयत्न केले आहेत⁹. परंतु एडिस इजिप्ती डासाविरुद्ध अशा संयुगांचे अभ्यास दुर्मिळ आहेत. वैद्यकीय शास्त्रातील प्रगती आणि औषधे व लसींच्या विकासामुळे काही कीटकजन्य रोगांचा सामना करण्यास मदत झाली आहे. परंतु एडिस इजिप्ती डासाद्वारे प्रसारित होणाऱ्या विषाणूच्या वेगवेगळ्या सेरोटाइपच्या उपस्थितीमुळे लसीकरण कार्यक्रम अयशस्वी ठरले आहेत. त्यामुळे, जेव्हा असे रोग उद्भवतात, तेव्हा रोगाचा प्रसार रोखण्यासाठी कीटक नियंत्रण कार्यक्रम हा एकमेव पर्याय असतो. सध्याच्या परिस्थितीत, एडीस इजिप्ती डासाचे नियंत्रण अत्यंत महत्त्वाचे आहे, कारण तो डेंग्यू ताप, झिका, डेंग्यू रक्तस्रावी ताप, पिवळा ताप इत्यादी आजारांना कारणीभूत ठरणारे विविध विषाणू आणि त्यांच्या सेरोटाइप्सचा एक प्रमुख वाहक आहे. सर्वात उल्लेखनीय बाब म्हणजे, इजिप्तमध्ये आणि जगभरातही एडीस डासांमुळे पसरणाऱ्या जवळपास सर्वच रोगांच्या रुग्णांची संख्या दरवर्षी वाढत आहे. त्यामुळे, या संदर्भात, एडीस इजिप्तीच्या प्रादुर्भावासाठी पर्यावरणपूरक आणि प्रभावी नियंत्रण उपाय विकसित करण्याची तातडीची गरज आहे. या संदर्भात, आवश्यक तेले (EOs), त्यांचे घटक संयुगे आणि त्यांचे मिश्रण हे संभाव्य पर्याय आहेत. म्हणूनच, या अभ्यासात एडीस इजिप्ती डासाविरुद्ध कीटकनाशक गुणधर्म असलेल्या पाच वनस्पतींमधील (म्हणजेच, पुदिना, तुळस, निलगिरी, एलियम सल्फर आणि मेलॅल्युका) प्रमुख वनस्पती आवश्यक तेलांच्या संयुगांचे प्रभावी सहक्रियात्मक मिश्रण ओळखण्याचा प्रयत्न केला गेला.
निवडलेल्या सर्व आवश्यक तेलांनी (EOs) एडीस इजिप्टी (Aedes aegypti) विरुद्ध संभाव्य अळीनाशक क्रिया दर्शविली, ज्यामध्ये 24-तासांचे LC50 मूल्य 0.42 ते 163.65 ppm पर्यंत होते. सर्वाधिक अळीनाशक क्रिया पेपरमिंट (Mp) आवश्यक तेलासाठी नोंदवली गेली, ज्याचे 24 तासांत LC50 मूल्य 0.42 ppm होते, त्यानंतर लसूण (As) आवश्यक तेलाचे 24 तासांत LC50 मूल्य 16.19 ppm होते (तक्ता 1).
तुळशीच्या तेलाचा (Ocimum Sainttum) अपवाद वगळता, तपासलेल्या इतर चारही तेलांनी स्पष्ट ऍलर्जीनाशक परिणाम दर्शवले, ज्यांची LC50 मूल्ये २४ तासांच्या संपर्काच्या कालावधीत २३.३७ ते १२०.१६ पीपीएम पर्यंत होती. प्रौढ कीटकांना मारण्यात थायमोफिलस स्ट्रायटा (Cl) तेल सर्वात प्रभावी ठरले, ज्याचे LC50 मूल्य २४ तासांच्या संपर्कात २३.३७ पीपीएम होते, त्यानंतर युकॅलिप्टस मॅक्युलाटा (Em) होते, ज्याचे LC50 मूल्य १०१.९१ पीपीएम होते (तक्ता १). दुसरीकडे, ओएस (Os) साठी LC50 मूल्य अद्याप निश्चित केलेले नाही, कारण सर्वाधिक मात्रेवर ५३% इतका सर्वाधिक मृत्यूदर नोंदवला गेला (पूरक आकृती ३).
प्रत्येक ईओ मधील दोन प्रमुख घटक संयुगे एनआयएसटी लायब्ररी डेटाबेस परिणाम, जीसी क्रोमॅटोग्राम क्षेत्र टक्केवारी आणि एमएस स्पेक्ट्रा परिणामांच्या आधारे ओळखली आणि निवडली गेली (तक्ता २). ईओ एएस साठी, ओळखलेली मुख्य संयुगे डायॲलिल डायसल्फाइड आणि डायॲलिल ट्रायसल्फाइड होती; ईओ एमपी साठी ओळखलेली मुख्य संयुगे कार्व्होन आणि लिमोनेन होती, ईओ एम साठी ओळखलेली मुख्य संयुगे युडेस्मोल आणि युकॅलिप्टोल होती; ईओ ओएस साठी, ओळखलेली मुख्य संयुगे युजेनॉल आणि मिथाइल युजेनॉल होती, आणि ईओ सीएल साठी, ओळखलेली मुख्य संयुगे युजेनॉल आणि α-पिनेन होती (आकृती १, पूरक आकृत्या ५-८, पूरक तक्ता १-५).
निवडक सुगंधी तेलांमधील मुख्य टर्पेनॉइड्सच्या मास स्पेक्ट्रोमेट्रीचे परिणाम (A-डायॲलिल डायसल्फाइड; B-डायॲलिल ट्रायसल्फाइड; C-युजेनॉल; D-मिथाइल युजेनॉल; E-लिमोनेन; F-ॲरोमॅटिक सेपरोन; G-α-पिनेन; H-सिनेओल; R-यूडामोल).
एकूण नऊ संयुगे (डायॲलिल डायसल्फाइड, डायॲलिल ट्रायसल्फाइड, युजेनॉल, मिथाइल युजेनॉल, कार्व्होन, लिमोनेन, युकॅलिप्टॉल, युडेस्मॉल, α-पिनेन) ही आवश्यक तेलाचे (EO) मुख्य घटक असून, ती प्रभावी संयुगे म्हणून ओळखली गेली आणि त्यांची एडीस इजिप्टीच्या अळी अवस्थेवर स्वतंत्रपणे जैवचाचणी करण्यात आली. २४ तासांच्या संपर्कात आल्यानंतर, युडेस्मॉल या संयुगामध्ये २.२५ पीपीएमच्या एलसी५० (LC50) मूल्यासह सर्वाधिक अळीनाशक क्रियाशीलता दिसून आली. डायॲलिल डायसल्फाइड आणि डायॲलिल ट्रायसल्फाइड या संयुगांमध्येही संभाव्य अळीनाशक प्रभाव असल्याचे आढळले असून, त्यांचे सरासरी उपघातक डोस १०-२० पीपीएमच्या श्रेणीत आहेत. युजेनॉल, लिमोनेन आणि युकॅलिप्टॉल या संयुगांमध्ये पुन्हा मध्यम अळीनाशक क्रियाशीलता दिसून आली, ज्यांची एलसी५० (LC50) मूल्ये अनुक्रमे ६३.३५ पीपीएम आणि १३९.२९ पीपीएम होती. आणि अनुक्रमे २४ तासांनंतर १८१.३३ पीपीएम (तक्ता ३). तथापि, मिथाइल युजेनॉल आणि कार्व्होनची कोणतीही लक्षणीय अळीनाशक क्षमता सर्वोच्च मात्रेतही आढळली नाही, त्यामुळे एलसी५० (LC50) मूल्यांची गणना केली गेली नाही (तक्ता ३). कृत्रिम अळीनाशक टेमेफॉसची एडीस इजिप्टी विरुद्ध २४ तासांच्या संपर्कात ०.४३ पीपीएम (ppm) इतकी सरासरी प्राणघातक सांद्रता होती (तक्ता ३, पूरक तक्ता ६).
सात संयुगे (डायॲलिल डायसल्फाइड, डायॲलिल ट्रायसल्फाइड, युकॅलिप्टॉल, α-पिनिन, युडेस्मॉल, लिमोनिन आणि कार्व्होन) प्रभावी ईओ (EO) ची मुख्य संयुगे म्हणून ओळखली गेली आणि प्रौढ इजिप्शियन एडीस डासांवर त्यांची स्वतंत्रपणे चाचणी घेण्यात आली. प्रोबिट रिग्रेशन विश्लेषणानुसार, 24-तासांच्या संपर्काच्या वेळेत 1.82 पीपीएमच्या एलसी50 (LC50) मूल्यासह युडेस्मॉलमध्ये सर्वाधिक क्षमता असल्याचे आढळले, त्यानंतर 17.60 पीपीएमच्या एलसी50 मूल्यासह युकॅलिप्टॉलचा क्रमांक होता. चाचणी केलेल्या उर्वरित पाच संयुगांची एलसी50 मूल्ये 140.79 ते 737.01 पीपीएम पर्यंत होती आणि ती प्रौढांसाठी मध्यम हानिकारक होती (तक्ता 3). कृत्रिम ऑर्गनोफॉस्फोरस मॅलाथिऑन हे युडेस्मॉलपेक्षा कमी प्रभावी आणि इतर सहा संयुगांपेक्षा जास्त प्रभावी होते, 24-तासांच्या संपर्काच्या कालावधीत त्याचे एलसी50 मूल्य 5.44 पीपीएम होते (तक्ता 3, पूरक तक्ता 6).
सात प्रभावी प्रमुख संयुगे आणि ऑर्गनोफॉस्फोरस टेमेफोसेट यांची निवड करून, त्यांच्या LC50 मात्रांचे १:१ प्रमाणात द्विसंयुगे तयार करण्यात आली. एकूण २८ द्विसंयुगे तयार करून त्यांची एडीस इजिप्टी (Aedes aegypti) विरुद्ध अळीनाशक परिणामकारकतेसाठी चाचणी घेण्यात आली. नऊ संयुगे सहक्रियात्मक (synergistic), १४ संयुगे प्रतिरोधी (antagonistic) आणि पाच संयुगे अळीनाशक नसल्याचे आढळले. सहक्रियात्मक संयुगांमध्ये, डायॲलिल डायसल्फाइड आणि टेमोफोल यांचे संयुग सर्वात प्रभावी ठरले, ज्यात २४ तासांनंतर १००% मृत्यूदर दिसून आला (तक्ता ४). त्याचप्रमाणे, लिमोनेन आणि डायॲलिल डायसल्फाइड, तसेच युजेनॉल आणि थायमेटफॉस यांच्या मिश्रणांनी चांगली क्षमता दर्शवली, ज्यात ९८.३% अळी मृत्यूदर दिसून आला (तक्ता ५). उर्वरित ४ संयोग, म्हणजेच युडेस्मोल अधिक युकॅलिप्टोल, युडेस्मोल अधिक लिमोनेन, युकॅलिप्टोल अधिक अल्फा-पिनेन, अल्फा-पिनेन अधिक टेमेफॉस, यांनी देखील लक्षणीय अळीनाशक परिणामकारकता दर्शविली, ज्यामध्ये ९०% पेक्षा जास्त मृत्यूदर नोंदवला गेला. अपेक्षित मृत्यूदर ६०-७५% च्या जवळपास आहे. (तक्ता ४). तथापि, लिमोनेनचा अल्फा-पिनेन किंवा युकॅलिप्टससोबतचा संयोग प्रतिरोधी प्रतिक्रिया दर्शवितो. त्याचप्रमाणे, टेमेफॉसचा युजेनॉल किंवा युकॅलिप्टस किंवा युडेस्मोल किंवा डायॲलिल ट्रायसल्फाइडसोबतचा संयोग प्रतिरोधी परिणाम दर्शवितो. त्याचप्रमाणे, डायॲलिल डायसल्फाइड आणि डायॲलिल ट्रायसल्फाइडचा संयोग आणि यापैकी कोणत्याही संयुगाचा युडेस्मोल किंवा युजेनॉलसोबतचा संयोग त्यांच्या अळीनाशक क्रियेत प्रतिरोधी आहेत. युडेस्मोलचा युजेनॉल किंवा अल्फा-पिनेनसोबतच्या संयोगातही प्रतिरोधी परिणाम नोंदवला गेला आहे.
प्रौढ कीटकांवरील आम्लधर्मी प्रभावासाठी तपासलेल्या सर्व २८ द्विमिश्रणांपैकी, ७ संयोग सहक्रियात्मक होते, ६ संयोगांचा कोणताही परिणाम झाला नाही आणि १५ संयोग प्रतिरोधी होते. युडेस्मोल आणि निलगिरीचे मिश्रण, तसेच लिमोनीन आणि कार्व्होनचे मिश्रण इतर सहक्रियात्मक संयोगांपेक्षा अधिक प्रभावी असल्याचे आढळले, ज्यामध्ये २४ तासांनंतरचा मृत्यूदर अनुक्रमे ७६% आणि १००% होता (तक्ता ५). लिमोनीन आणि डायॲलिल ट्रायसल्फाइड वगळता इतर सर्व संयुगांच्या संयोगांसोबत मॅलाथिऑन सहक्रियात्मक प्रभाव दर्शवतो असे दिसून आले आहे. याउलट, डायॲलिल डायसल्फाइड आणि डायॲलिल ट्रायसल्फाइड यांचा, त्यांपैकी कोणत्याही एकासोबत निलगिरी, किंवा युकॅलिप्टोल, किंवा कार्व्होन, किंवा लिमोनीन यांच्या संयोगासोबत प्रतिरोधी परिणाम आढळला आहे. त्याचप्रमाणे, α-पिनिनचे युडेस्मोल किंवा लिमोनेनसोबत, युकॅलिप्टोलचे कार्व्होन किंवा लिमोनेनसोबत, आणि लिमोनेनचे युडेस्मोल किंवा मॅलाथिऑनसोबतचे संयोग प्रतिरोधी अळीनाशक परिणाम दर्शवतात. उर्वरित सहा संयोगांसाठी, अपेक्षित आणि प्रत्यक्ष मृत्यूदरात कोणताही लक्षणीय फरक नव्हता (तक्ता ५).
सहक्रियात्मक परिणाम आणि उपघातक डोसच्या आधारावर, मोठ्या संख्येने असलेल्या एडीस इजिप्टी डासांविरुद्ध त्यांची अळीनाशक विषारीता अखेरीस निवडली गेली आणि तिची पुढील चाचणी घेण्यात आली. निकालांवरून असे दिसून आले की, युजेनॉल-लिमोनेन, डायॲलिल डायसल्फाइड-लिमोनेन आणि डायॲलिल डायसल्फाइड-टायमफॉस या द्विसंयुगांचा वापर करून नोंदवलेला अळी मृत्यूदर १००% होता, तर अपेक्षित अळी मृत्यूदर अनुक्रमे ७६.४८%, ७२.१६% आणि ६३.४% होता (तक्ता ६). लिमोनेन आणि युडेस्मोल यांचे मिश्रण तुलनेने कमी प्रभावी होते, २४ तासांच्या संपर्काच्या कालावधीत ८८% अळी मृत्यूदर नोंदवला गेला (तक्ता ६). सारांश, निवडलेल्या चार द्विसंयुगांनी मोठ्या प्रमाणावर वापरल्यास एडीस इजिप्टी डासांविरुद्ध सहक्रियात्मक अळीनाशक परिणाम देखील दर्शवले (तक्ता ६).
प्रौढ एडीस इजिप्टीच्या मोठ्या लोकसंख्येवर नियंत्रण मिळवण्यासाठी प्रौढनाशक जैवचाचणीकरिता तीन सहक्रियात्मक संयोग निवडण्यात आले. कीटकांच्या मोठ्या वसाहतींवर चाचणी करण्यासाठी संयोग निवडण्याकरिता, आम्ही प्रथम दोन सर्वोत्तम सहक्रियात्मक टर्पीन संयोगांवर लक्ष केंद्रित केले, म्हणजेच कार्व्होन अधिक लिमोनेन आणि युकॅलिप्टॉल अधिक युडेस्मोल. दुसरे म्हणजे, कृत्रिम ऑर्गनोफॉस्फेट मॅलाथिऑन आणि टर्पेनॉइड्सच्या संयोगातून सर्वोत्तम सहक्रियात्मक संयोग निवडण्यात आला. आमचा विश्वास आहे की, मॅलाथिऑन आणि युडेस्मोलचा संयोग हा कीटकांच्या मोठ्या वसाहतींवर चाचणी करण्यासाठी सर्वोत्तम संयोग आहे, कारण यामध्ये सर्वाधिक मृत्यूदर दिसून आला आहे आणि संभाव्य घटकांची LC50 मूल्ये खूप कमी आहेत. मॅलाथिऑन हे α-पिनेन, डायॲलिल डायसल्फाइड, युकॅलिप्टस, कार्व्होन आणि युडेस्मोल यांच्या संयोगात सहक्रिया दर्शवते. परंतु जर आपण LC50 मूल्यांकडे पाहिले, तर युडेस्मोलचे मूल्य सर्वात कमी (2.25 ppm) आहे. मॅलाथिऑन, α-पिनिन, डायॲलिल डायसल्फाइड, युकॅलिप्टॉल आणि कार्व्होन यांची गणना केलेली LC50 मूल्ये अनुक्रमे 5.4, 716.55, 166.02, 17.6 आणि 140.79 पीपीएम होती. ही मूल्ये दर्शवतात की डोसच्या दृष्टीने मॅलाथिऑन आणि युडेस्मोल यांचे मिश्रण हे सर्वोत्तम मिश्रण आहे. निकालांवरून असे दिसून आले की, कार्व्होन अधिक लिमोनेन आणि युडेस्मोल अधिक मॅलाथिऑन यांच्या मिश्रणांमध्ये 61% ते 65% अपेक्षित मृत्यूदराच्या तुलनेत 100% मृत्यूदर दिसून आला. युडेस्मोल अधिक युकॅलिप्टॉल या दुसऱ्या मिश्रणामध्ये, 24 तासांच्या संपर्कात आल्यानंतर 78.66% मृत्यूदर दिसून आला, तर अपेक्षित मृत्यूदर 60% होता. प्रौढ एडीस इजिप्ती डासांवर मोठ्या प्रमाणावर वापरले असताही, निवडलेल्या तिन्ही मिश्रणांनी सहक्रियात्मक परिणाम दर्शवले (तक्ता 6).
या अभ्यासात, निवडक वनस्पतीजन्य आवश्यक तेलांनी जसे की एमपी, एस, ओएस, एम आणि सीएल यांनी एडीस इजिप्टीच्या अळी आणि प्रौढ अवस्थांवर आश्वासक प्राणघातक परिणाम दर्शवले. एमपी आवश्यक तेलाची अळीनाशक क्रियाशीलता सर्वाधिक होती, ज्याचे एलसी५० मूल्य ०.४२ पीपीएम होते, त्यानंतर एस, ओएस आणि एम आवश्यक तेलांचे एलसी५० मूल्य २४ तासांनंतर ५० पीपीएम पेक्षा कमी होते. हे परिणाम डास आणि इतर डिप्टेरस माश्यांवरील मागील अभ्यासांशी सुसंगत आहेत१०,११,१२,१३,१४. जरी सीएलची अळीनाशक क्षमता इतर आवश्यक तेलांपेक्षा कमी असली, ज्याचे एलसी५० मूल्य २४ तासांनंतर १६३.६५ पीपीएम आहे, तरीही त्याची प्रौढ कीटकांवरील क्षमता सर्वाधिक आहे, ज्याचे एलसी५० मूल्य २४ तासांनंतर २३.३७ पीपीएम आहे. Mp, As आणि Em EOs ने देखील 24 तासांच्या संपर्कात 100-120 ppm च्या श्रेणीतील LC50 मूल्यांसह चांगली ऍलर्जीनाशक क्षमता दर्शविली, परंतु ती त्यांच्या अळीनाशक प्रभावीतेपेक्षा तुलनेने कमी होती. दुसरीकडे, EO Os ने अगदी सर्वोच्च उपचारात्मक डोसवर देखील नगण्य ऍलर्जीनाशक प्रभाव दर्शविला. अशाप्रकारे, परिणाम सूचित करतात की वनस्पतींसाठी एथिलीन ऑक्साईडची विषारीता डासांच्या विकासाच्या टप्प्यावर अवलंबून बदलू शकते¹⁵. हे EOs च्या कीटकांच्या शरीरात प्रवेश करण्याच्या दरावर, विशिष्ट लक्ष्य एन्झाइम्ससोबतच्या त्यांच्या आंतरक्रियेवर आणि प्रत्येक विकासाच्या टप्प्यावर डासाच्या विषहरण क्षमतेवर देखील अवलंबून असते¹⁶. अनेक अभ्यासांनी दाखवले आहे की मुख्य घटक संयुग हे एथिलीन ऑक्साईडच्या जैविक क्रियेतील एक महत्त्वाचा घटक आहे, कारण ते एकूण संयुगांमध्ये बहुसंख्य असते³,¹²,¹⁷,¹⁸. म्हणून, आम्ही प्रत्येक EO मधील दोन मुख्य संयुगे विचारात घेतली. GC-MS परिणामांनुसार, डायॲलिल डायसल्फाइड आणि डायॲलिल ट्रायसल्फाइड हे EO As चे प्रमुख संयुगे म्हणून ओळखले गेले, जे मागील अहवालांशी सुसंगत आहे¹⁹,²⁰,²¹. जरी मागील अहवालांमध्ये मेंथॉल हे त्यातील मुख्य संयुगांपैकी एक असल्याचे सूचित केले होते, तरीही कार्वोन आणि लिमोनेन हे Mp EO चे मुख्य संयुगे म्हणून पुन्हा ओळखले गेले²²,²³. Os EO च्या रचना प्रोफाइलने दाखवले की युजेनॉल आणि मिथाइल युजेनॉल हे मुख्य संयुगे आहेत, जे पूर्वीच्या संशोधकांच्या निष्कर्षांसारखेच आहे¹⁶,²⁴. Em पानांच्या तेलामध्ये युकॅलिप्टॉल आणि युकॅलिप्टॉल हे मुख्य संयुगे असल्याचे नोंदवले गेले आहे, जे काही संशोधकांच्या निष्कर्षांशी सुसंगत आहे²⁵,²⁶ परंतु ओलालाडे एट अल.²⁷ यांच्या निष्कर्षांच्या विरुद्ध आहे. मेलालेउका इसेन्शियल ऑइलमध्ये सिनेओल आणि α-पिनेनचे प्राबल्य दिसून आले, जे मागील अभ्यासांसारखेच आहे²⁸,²⁹. वेगवेगळ्या ठिकाणी एकाच वनस्पती प्रजातीमधून काढलेल्या आवश्यक तेलांच्या रचनेतील आणि सांद्रतेतील आंतरप्रजातीय फरक नोंदवले गेले आहेत आणि या अभ्यासातही ते दिसून आले, जे भौगोलिक वनस्पती वाढीच्या परिस्थिती, कापणीची वेळ, विकासाचा टप्पा किंवा वनस्पतीचे वय, केमोटाइप्सचे स्वरूप इत्यादींमुळे प्रभावित होतात.२२,३०,३१,३२. त्यानंतर ओळखलेली प्रमुख संयुगे खरेदी करून त्यांच्या अळीनाशक परिणामांसाठी आणि प्रौढ एडीस इजिप्टी डासांवरील परिणामांसाठी तपासण्यात आली. निकालांवरून असे दिसून आले की डायॲलिल डायसल्फाइडची अळीनाशक क्रियाशीलता कच्च्या आवश्यक तेलाच्या (EO As) तुलनेत सारखीच होती. परंतु डायॲलिल ट्रायसल्फाइडची क्रियाशीलता आवश्यक तेलापेक्षा (EO As) जास्त आहे. हे निकाल किंबारिस आणि सहकाऱ्यांनी ३३ क्युलेक्स फिलीपिन्सवर मिळवलेल्या निकालांसारखेच आहेत. तथापि, या दोन संयुगांनी लक्ष्यित डासांविरुद्ध चांगली स्व-नाशक क्रियाशीलता दर्शविली नाही, जे प्लाटा-रुएडा आणि सहकाऱ्यांनी ३४ टेनेब्रिओ मोलिटरवर केलेल्या अभ्यासाच्या निकालांशी सुसंगत आहे. Os EO हे एडीस इजिप्टीच्या अळी अवस्थेवर प्रभावी आहे, परंतु प्रौढ अवस्थेवर नाही. हे सिद्ध झाले आहे की मुख्य वैयक्तिक संयुगांची अळीनाशक क्रियाशीलता ही कच्च्या Os EO पेक्षा कमी आहे. यावरून असे सूचित होते की कच्च्या एथिलीन ऑक्साईडमधील इतर संयुगे आणि त्यांच्या आंतरक्रियांची भूमिका आहे. केवळ मिथाइल युजेनॉलची क्रियाशीलता नगण्य आहे, तर केवळ युजेनॉलची अळीनाशक क्रियाशीलता मध्यम आहे. हा निष्कर्ष, एकीकडे,35,36 पूर्वीच्या संशोधकांच्या निष्कर्षांची पुष्टी करतो आणि दुसरीकडे,37,38 त्यांच्याशी विसंगत आहे. युजेनॉल आणि मिथाइलयुजेनॉलच्या कार्यात्मक गटांमधील फरकांमुळे एकाच लक्ष्य कीटकासाठी वेगवेगळी विषारीता असू शकते39. लिमोनेनमध्ये मध्यम अळीनाशक क्रियाशीलता आढळली, तर कार्वोनचा प्रभाव नगण्य होता. त्याचप्रमाणे, प्रौढ कीटकांप्रति लिमोनेनची तुलनेने कमी विषारीता आणि कार्वोनची उच्च विषारीता काही पूर्वीच्या अभ्यासांच्या निष्कर्षांना समर्थन देते40 परंतु इतरांशी विसंगत आहे41. आंतरचक्रीय आणि बाह्यचक्रीय दोन्ही ठिकाणी दुहेरी बंधांच्या उपस्थितीमुळे या संयुगांचे अळीनाशक म्हणून फायदे वाढू शकतात³,⁴¹, तर कार्व्होन, जे असंतृप्त अल्फा आणि बीटा कार्बन असलेले कीटोन आहे, प्रौढांमध्ये विषारीपणाची उच्च क्षमता दर्शवू शकते⁴². तथापि, लिमोनेन आणि कार्व्होनची वैयक्तिक वैशिष्ट्ये एकूण ईओ एमपी (सारणी १, सारणी ३) पेक्षा खूपच कमी आहेत. चाचणी केलेल्या टर्पेनॉइड्सपैकी, युडेस्मोलमध्ये २.५ पीपीएम पेक्षा कमी एलसी५० मूल्यासह सर्वाधिक अळीनाशक आणि प्रौढ क्रियाशीलता आढळली, ज्यामुळे ते एडीस डासांच्या नियंत्रणासाठी एक आशादायक संयुग ठरते. त्याची कामगिरी संपूर्ण ईओ एम पेक्षा चांगली आहे, जरी हे चेंग एट अल.⁴⁰ यांच्या निष्कर्षांशी सुसंगत नाही. युडेस्मोल हे दोन आयसोप्रीन युनिट्स असलेले एक सेस्क्विटर्पीन आहे जे निलगिरीसारख्या ऑक्सिजनेटेड मोनो-टर्पीनपेक्षा कमी बाष्पशील आहे आणि म्हणूनच कीटकनाशक म्हणून त्यात अधिक क्षमता आहे. युकॅलिप्टॉलमध्ये स्वतःमध्ये अळीनाशक क्रियेपेक्षा प्रौढ कीटकांवर अधिक क्रियाशीलता असते आणि पूर्वीच्या अभ्यासांमधील निष्कर्ष याला समर्थन आणि खंडन दोन्ही करतात37,43,44. ही क्रियाशीलता एकटीच संपूर्ण ईओसीएलच्या (EO Cl) क्रियाशीलतेशी जवळपास तुलना करण्याजोगी आहे. दुसरे बायसायक्लिक मोनो-टर्पीन, अल्फा-पिनिन, याचा एडिस इजिप्टीवर प्रौढ कीटकांवरील परिणाम अळीनाशक परिणामापेक्षा कमी असतो, जो संपूर्ण ईओसीएलच्या परिणामाच्या विरुद्ध आहे. टर्पेनॉइड्सची एकूण कीटकनाशक क्रियाशीलता त्यांच्या लिपोफिलिसिटी, बाष्पशीलता, कार्बन शाखा, प्रक्षेपण क्षेत्र, पृष्ठभाग क्षेत्र, कार्यात्मक गट आणि त्यांच्या स्थानांवर अवलंबून असते45,46. ही संयुगे पेशींचा संचय नष्ट करून, श्वसन क्रिया रोखून, चेता आवेगांच्या प्रसारणात व्यत्यय आणून इत्यादी प्रकारे कार्य करू शकतात.47 संश्लेषित ऑर्गनोफॉस्फेट टेमेफॉसमध्ये 0.43 पीपीएमच्या एलसी50 (LC50) मूल्यासह सर्वाधिक अळीनाशक क्रियाशीलता आढळली, जी लेकच्या डेटाशी सुसंगत आहे - उटाला48. संश्लेषित ऑर्गनोफॉस्फोरस मॅलाथिऑनची प्रौढ डासांमधील क्रियाशीलता ५.४४ पीपीएमवर नोंदवली गेली. जरी या दोन ऑर्गनोफॉस्फेट्सनी एडीस इजिप्टीच्या प्रयोगशाळेतील प्रजातींविरुद्ध अनुकूल प्रतिसाद दर्शवला असला तरी, जगाच्या विविध भागांमध्ये या संयुगांविरुद्ध डासांमध्ये प्रतिकारशक्ती निर्माण झाल्याचे नोंदवले गेले आहे४९. तथापि, हर्बल औषधांविरुद्ध प्रतिकारशक्ती विकसित झाल्याचे असे कोणतेही अहवाल आढळले नाहीत५०. त्यामुळे, रोगवाहक नियंत्रण कार्यक्रमांमध्ये रासायनिक कीटकनाशकांना संभाव्य पर्याय म्हणून वनस्पतीजन्य पदार्थांचा विचार केला जातो.
शक्तिशाली टर्पेनॉइड्स आणि थायमेटफॉससह टर्पेनॉइड्सपासून तयार केलेल्या २८ द्विसंयुजी संयोजनांवर (१:१) अळीनाशक परिणामाची चाचणी घेण्यात आली, आणि त्यापैकी ९ संयोजने सहक्रियात्मक, १४ प्रतिरोधी आणि ५ प्रतिरोधी असल्याचे आढळले. कोणताही परिणाम दिसून आला नाही. दुसरीकडे, प्रौढ कीटकांच्या क्षमता चाचणीमध्ये, ७ संयोजने सहक्रियात्मक, १५ संयोजने प्रतिरोधी असल्याचे आढळले, आणि ६ संयोजनांचा कोणताही परिणाम झाला नाही असे नोंदवले गेले. काही विशिष्ट संयोजनांमध्ये सहक्रियात्मक परिणाम दिसून येण्याचे कारण असे असू शकते की, संभाव्य संयुगे एकाच वेळी वेगवेगळ्या महत्त्वाच्या मार्गांमध्ये आंतरक्रिया करतात, किंवा एखाद्या विशिष्ट जैविक मार्गातील वेगवेगळ्या प्रमुख एन्झाइम्सचे अनुक्रमिक अवरोधन करतात. लिमोनेनचे डायॲलिल डायसल्फाइड, निलगिरी किंवा युजेनॉलसोबतचे संयोजन लहान आणि मोठ्या प्रमाणावरील दोन्ही प्रयोगांमध्ये सहक्रियात्मक असल्याचे आढळले (तक्ता ६), तर त्याचे निलगिरी किंवा α-पिनेनसोबतचे संयोजन अळ्यांवर प्रतिरोधी परिणाम दर्शवते असे आढळले. सरासरी, लिमोनेन एक चांगला सहक्रियाकारक असल्याचे दिसून येते, कदाचित मिथाइल गटांची उपस्थिती, स्ट्रॅटम कॉर्नियममध्ये चांगला प्रवेश आणि वेगळ्या कार्यप्रणालीमुळे52,53. पूर्वी असे नोंदवले गेले आहे की लिमोनेन कीटकांच्या क्यूटिकल्समध्ये प्रवेश करून (संपर्क विषारीपणा), पचनसंस्थेवर परिणाम करून (अँटीफीडंट), किंवा श्वसनसंस्थेवर परिणाम करून (फ्युमिगेशन क्रिया) विषारी परिणाम करू शकते,54 तर युजेनॉलसारखे फेनिलप्रोपेनॉइड्स चयापचय एन्झाइम्सवर परिणाम करू शकतात55. म्हणून, वेगवेगळ्या कार्यप्रणाली असलेल्या संयुगांचे संयोजन मिश्रणाचा एकूण प्राणघातक परिणाम वाढवू शकते. युकॅलिप्टॉल हे डायॲलिल डायसल्फाइड, युकॅलिप्टस किंवा α-पिनेनसोबत सहक्रियाकारक असल्याचे आढळले, परंतु इतर संयुगांसोबतची इतर संयोजने एकतर अळीनाशक नव्हती किंवा प्रतिरोधी होती. सुरुवातीच्या अभ्यासातून असे दिसून आले की युकॅलिप्टॉलमध्ये ॲसिटिलकोलिनस्टेरेज (AChE), तसेच ऑक्टामाइन आणि GABA रिसेप्टर्सवर प्रतिबंधात्मक क्रिया आहे56. चक्रीय मोनो-टर्पीन्स, युकॅलिप्टॉल, युजेनॉल इत्यादींची क्रिया करण्याची पद्धत त्यांच्या न्यूरोटॉक्सिक क्रियेसारखीच असू शकते, 57 ज्यामुळे परस्पर प्रतिबंधाद्वारे त्यांचे एकत्रित परिणाम कमी होतात. त्याचप्रमाणे, टेमेफॉसचे डायअलाइल डायसल्फाइड, α-पिनिन आणि लिमोनेन यांच्यासोबतचे मिश्रण सहक्रियात्मक असल्याचे आढळले, जे हर्बल उत्पादने आणि कृत्रिम ऑर्गनोफॉस्फेट्स यांच्यातील सहक्रियात्मक परिणामाच्या पूर्वीच्या अहवालांना58 पुष्टी देते.
युडेस्मोल आणि युकॅलिप्टोल यांच्या मिश्रणाचा एडीस इजिप्टीच्या अळी आणि प्रौढ अवस्थांवर सहक्रियात्मक परिणाम आढळून आला, जो कदाचित त्यांच्या भिन्न रासायनिक संरचनांमुळे त्यांच्या वेगवेगळ्या कार्यपद्धतींमुळे असावा. युडेस्मोल (एक सेस्क्विटरपीन) श्वसन प्रणालीवर परिणाम करू शकते ५९ आणि युकॅलिप्टोल (एक मोनोटरपीन) ॲसिटिलकोलिनस्टेरेजवर परिणाम करू शकते ६०. दोन किंवा अधिक लक्ष्य स्थळांवर या घटकांचा एकाच वेळी संपर्क आल्यास मिश्रणाचा एकूण प्राणघातक परिणाम वाढू शकतो. प्रौढ पदार्थ जैवचाचण्यांमध्ये, मॅलाथिऑन हे कार्व्होन किंवा युकॅलिप्टोल किंवा डायॲलिल डायसल्फाइड किंवा α-पिनिन यांच्यासोबत सहक्रियात्मक असल्याचे आढळून आले, जे दर्शवते की ते लिमोनेन आणि डाय यांच्या संयोगाने सहक्रियात्मक आहे. ॲलिल ट्रायसल्फाइड वगळता, टरपीन संयुगांच्या संपूर्ण पोर्टफोलिओसाठी चांगले सहक्रियात्मक ॲलर्साइड उमेदवार. थंगम आणि कथिरेशन६१ यांनी देखील वनस्पती अर्कांसोबत मॅलाथिऑनच्या सहक्रियात्मक परिणामाचे असेच निष्कर्ष नोंदवले आहेत. हा सहक्रियात्मक प्रतिसाद कीटकांच्या विषनाशक एन्झाइम्सवर मॅलाथिऑन आणि फायटोकेमिकल्सच्या एकत्रित विषारी परिणामांमुळे असू शकतो. मॅलाथिऑनसारखे ऑर्गनोफॉस्फेट्स सामान्यतः सायटोक्रोम पी४५० एस्टेरेसेस आणि मोनोऑक्सिजेनेस६२,६३,६४ यांना रोखून कार्य करतात. त्यामुळे, या कार्यप्रणाली असलेल्या मॅलाथिऑनला आणि वेगळ्या कार्यप्रणाली असलेल्या टर्पीन्सना एकत्र केल्यास डासांवरील एकूण प्राणघातक परिणाम वाढू शकतो.
दुसरीकडे, प्रतिरोधन हे दर्शवते की निवडलेली संयुगे एकत्रितपणे प्रत्येक संयुगापेक्षा कमी सक्रिय असतात. काही संयोजनांमध्ये प्रतिरोधनाचे कारण असे असू शकते की एक संयुग शोषण, वितरण, चयापचय किंवा उत्सर्जनाचा दर बदलून दुसऱ्या संयुगाच्या वर्तनात बदल घडवते. सुरुवातीच्या संशोधकांनी औषध संयोजनांमधील प्रतिरोधनाचे हेच कारण मानले होते. रेणू संभाव्य यंत्रणा ६५. त्याचप्रमाणे, प्रतिरोधनाची संभाव्य कारणे समान कार्यप्रणाली, एकाच रिसेप्टर किंवा लक्ष्य स्थळासाठी घटक संयुगांमधील स्पर्धा यांच्याशी संबंधित असू शकतात. काही प्रकरणांमध्ये, लक्ष्य प्रथिनाचे गैर-स्पर्धात्मक अवरोधन देखील होऊ शकते. या अभ्यासात, डायॲलिल डायसल्फाइड आणि डायॲलिल ट्रायसल्फाइड या दोन ऑर्गनोसल्फर संयुगांनी प्रतिरोधनात्मक परिणाम दर्शवले, जे शक्यतो एकाच लक्ष्य स्थळासाठीच्या स्पर्धेमुळे होते. त्याचप्रमाणे, या दोन सल्फर संयुगांनी प्रतिरोधनात्मक परिणाम दर्शवले आणि युडेस्मोल व α-पिनिन यांच्यासोबत एकत्रित केल्यावर त्यांचा कोणताही परिणाम झाला नाही. युडेस्मोल आणि अल्फा-पिनिन हे चक्रीय स्वरूपाचे आहेत, तर डायॲलिल डायसल्फाइड आणि डायॲलिल ट्रायसल्फाइड हे अ‍ॅलिफॅटिक स्वरूपाचे आहेत. रासायनिक संरचनेच्या आधारावर, या संयुगांच्या संयोगाने एकूण प्राणघातक क्रियाशीलता वाढली पाहिजे, कारण त्यांची लक्ष्य स्थळे सहसा भिन्न असतात³⁴,⁴⁷, परंतु प्रायोगिकरित्या आम्हाला प्रतिरोधात्मकता आढळली, जी आंतरक्रियेच्या परिणामी काही अज्ञात जीवांमध्ये या संयुगांच्या भूमिकेमुळे असू शकते. त्याचप्रमाणे, सिनेओल आणि अल्फा-पिनिनच्या संयोगाने प्रतिरोधात्मक प्रतिसाद निर्माण केले, जरी संशोधकांनी पूर्वी नोंदवले होते की या दोन संयुगांची क्रिया लक्ष्ये भिन्न आहेत⁴⁷,⁶⁰. दोन्ही संयुगे चक्रीय मोनो-टर्पेन्स असल्याने, काही सामान्य लक्ष्य स्थळे असू शकतात जी बंधनासाठी स्पर्धा करू शकतात आणि अभ्यासलेल्या संयोगी जोड्यांच्या एकूण विषारीपणावर प्रभाव टाकू शकतात.
LC50 मूल्यांवर आणि निरीक्षित मृत्यूदरावर आधारित, दोन सर्वोत्तम सहक्रियात्मक टर्पीन संयोग निवडण्यात आले, म्हणजेच कार्व्होन + लिमोनेन आणि युकॅलिप्टोल + युडेस्मोल यांच्या जोड्या, तसेच टर्पीनसह संश्लेषित ऑर्गनोफॉस्फोरस मॅलाथिऑन. मॅलाथिऑन + युडेस्मोल संयुगांच्या इष्टतम सहक्रियात्मक संयोगाची प्रौढ कीटकनाशक जैवचाचणीमध्ये तपासणी करण्यात आली. हे प्रभावी संयोग तुलनेने मोठ्या संपर्क क्षेत्रात मोठ्या संख्येने असलेल्या कीटकांविरुद्ध काम करू शकतात की नाही, हे तपासण्यासाठी कीटकांच्या मोठ्या वसाहतींना लक्ष्य करण्यात आले. या सर्व संयोगांनी कीटकांच्या मोठ्या थव्यांविरुद्ध सहक्रियात्मक परिणाम दर्शवला. एडीस इजिप्टीच्या अळ्यांच्या मोठ्या लोकसंख्येवर तपासलेल्या एका इष्टतम सहक्रियात्मक अळीनाशक संयोगासाठीही असेच परिणाम प्राप्त झाले. अशाप्रकारे, असे म्हणता येईल की वनस्पती ईओ संयुगांचा प्रभावी सहक्रियात्मक अळीनाशक आणि प्रौढनाशक संयोग हा सध्याच्या संश्लेषित रसायनांविरुद्ध एक प्रबळ दावेदार आहे आणि एडीस इजिप्टीच्या लोकसंख्येवर नियंत्रण ठेवण्यासाठी त्याचा पुढे वापर केला जाऊ शकतो. त्याचप्रमाणे, डासांना दिल्या जाणाऱ्या थायमेटफॉस किंवा मॅलाथिऑनची मात्रा कमी करण्यासाठी, कृत्रिम अळीनाशके किंवा प्रौढनाशकांची टर्पीन्ससोबतची प्रभावी मिश्रणे देखील वापरली जाऊ शकतात. ही शक्तिशाली सहक्रियात्मक मिश्रणे एडीस डासांमधील औषध-प्रतिरोधकतेच्या उत्क्रांतीवरील भविष्यातील अभ्यासासाठी उपाय प्रदान करू शकतात.
एडीस इजिप्ती (Aedes aegypti) डासांची अंडी प्रादेशिक वैद्यकीय संशोधन केंद्र, दिब्रुगढ, भारतीय वैद्यकीय संशोधन परिषद येथून गोळा करण्यात आली आणि गुवाहाटी विद्यापीठाच्या प्राणीशास्त्र विभागात नियंत्रित तापमान (२८ ± १ °C) आणि आर्द्रता (८५ ± ५%) मध्ये खालील परिस्थितीत ठेवण्यात आली: अरिवोली इत्यादींनी वर्णन केले आहे. अंडी उबल्यानंतर, अळ्यांना अळ्यांचे खाद्य (कुत्र्याच्या बिस्किटांची पावडर आणि यीस्ट ३:१ प्रमाणात) देण्यात आले आणि प्रौढ डासांना १०% ग्लुकोजचे द्रावण देण्यात आले. बाहेर पडल्यानंतर तिसऱ्या दिवसापासून, प्रौढ मादी डासांना अल्बिनो उंदरांचे रक्त शोषू दिले गेले. एका ग्लासात फिल्टर पेपर पाण्यात भिजवून तो अंडी घालण्याच्या पिंजऱ्यात ठेवा.
निवडक वनस्पतींचे नमुने, म्हणजेच निलगिरीची पाने (मर्टेसी), तुळस (लॅमिएसी), पुदिना (लॅमिएसी), मेलॅल्युका (मर्टेसी) आणि एलियमचे कंद (अमॅरिलिडेसी). हे नमुने गुवाहाटी येथून गोळा करण्यात आले आणि गौहाटी विद्यापीठाच्या वनस्पतीशास्त्र विभागाने त्यांची ओळख पटवली. गोळा केलेल्या वनस्पतींच्या नमुन्यांवर (५०० ग्रॅम) क्लेव्हेंजर उपकरणाचा वापर करून ६ तासांसाठी हायड्रोडिस्टिलेशन प्रक्रिया करण्यात आली. काढलेला आवश्यक तेल (EO) स्वच्छ काचेच्या कुप्यांमध्ये गोळा करून पुढील अभ्यासासाठी ४°C तापमानावर साठवून ठेवण्यात आला.
जागतिक आरोग्य संघटनेच्या प्रमाणित कार्यपद्धती ६७ मध्ये किंचित बदल करून अळीनाशक विषारीपणाचा अभ्यास करण्यात आला. इमल्सीफायर म्हणून DMSO वापरा. ​​प्रत्येक EO सांद्रता सुरुवातीला १०० आणि १००० पीपीएमवर तपासण्यात आली, प्रत्येक प्रतिकृतीमध्ये २० अळ्यांना सामोरे जावे लागले. निकालांच्या आधारावर, सांद्रतेची एक श्रेणी लागू करण्यात आली आणि उपचारानंतर १ तास ते ६ तासांपर्यंत (१ तासाच्या अंतराने), आणि २४ तास, ४८ तास आणि ७२ तासांनी मृत्यूची नोंद करण्यात आली. २४, ४८ आणि ७२ तासांच्या संपर्कात आल्यानंतर उपघातक सांद्रता (LC50) निश्चित करण्यात आली. प्रत्येक सांद्रतेची चाचणी एका नकारात्मक नियंत्रणासह (फक्त पाणी) आणि एका सकारात्मक नियंत्रणासह (DMSO-उपचारित पाणी) तीन प्रतिकृतींमध्ये करण्यात आली. जर कोष तयार झाला आणि नियंत्रण गटातील १०% पेक्षा जास्त अळ्या मेल्या, तर प्रयोग पुन्हा केला जातो. जर नियंत्रण गटातील मृत्यू दर ५-१०% च्या दरम्यान असेल, तर ॲबॉट सुधारणा सूत्र ६८ वापरा.
रामार आणि सहकाऱ्यांनी वर्णन केलेली पद्धत ६९, ॲसिटोन हे द्रावक म्हणून वापरून एडीस इजिप्टी डासांविरुद्ध प्रौढ जैविक चाचणीसाठी वापरण्यात आली. प्रत्येक आवश्यक तेलाची (EO) सुरुवातीला प्रौढ एडीस इजिप्टी डासांवर १०० आणि १००० पीपीएम या सांद्रतांवर चाचणी घेण्यात आली. प्रत्येक तयार केलेल्या द्रावणाचे २ मिली, फिल्टर पेपरच्या एका तुकड्यावर (आकार १२ x १५ सेमी²) लावा आणि ॲसिटोनला १० मिनिटे बाष्पीभवन होऊ द्या. केवळ २ मिली ॲसिटोनने प्रक्रिया केलेला फिल्टर पेपर नियंत्रक म्हणून वापरण्यात आला. ॲसिटोनचे बाष्पीभवन झाल्यावर, प्रक्रिया केलेला फिल्टर पेपर आणि नियंत्रक फिल्टर पेपर एका दंडगोलाकार नळीत (१० सेमी खोल) ठेवण्यात आले. ३ ते ४ दिवसांच्या, रक्त न पिणाऱ्या दहा डासांना प्रत्येक सांद्रतेच्या तीन प्रतींमध्ये स्थानांतरित करण्यात आले. प्राथमिक चाचण्यांच्या निकालांवर आधारित, निवडलेल्या तेलांच्या विविध सांद्रतांची चाचणी घेण्यात आली. डास सोडल्यानंतर १ तास, २ तास, ३ तास, ४ तास, ५ तास, ६ तास, २४ तास, ४८ तास आणि ७२ तासांनी मृत्यूची नोंद घेण्यात आली. २४ तास, ४८ तास आणि ७२ तासांच्या संपर्क कालावधीसाठी LC50 मूल्यांची गणना करा. जर नियंत्रण गटातील मृत्यू दर २०% पेक्षा जास्त असेल, तर संपूर्ण चाचणी पुन्हा करा. त्याचप्रमाणे, जर नियंत्रण गटातील मृत्यू दर ५% पेक्षा जास्त असेल, तर ॲबॉटच्या सूत्र68 चा वापर करून उपचारित नमुन्यांसाठी निकालांमध्ये बदल करा.
निवडलेल्या सुगंधी तेलांमधील घटक संयुगांचे विश्लेषण करण्यासाठी गॅस क्रोमॅटोग्राफी (Agilent 7890A) आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री (Accu TOF GCv, Jeol) करण्यात आली. जीसीमध्ये एफआयडी डिटेक्टर आणि एक कॅपिलरी कॉलम (HP5-MS) बसवलेला होता. वाहक वायू हेलियम होता आणि प्रवाहाचा वेग १ मिली/मिनिट होता. GC प्रोग्राम Allium sativum साठी 10:80-1M-8-220-5M-8-270-9M आणि Ocimum Sainttum साठी 10:80-3M-8-200-3M-10-275-1M-5 – 280, मिंटसाठी 10:80-1M-8-200-5M-8-275-1M-5-280, निलगिरीसाठी 20.60-1M-10-200-3M-30-280, आणि लाल रंगासाठी हजार थरांकरिता 10: 60-1M-8-220-5M-8-270-3M असे सेट करतो.
GC क्रोमॅटोग्राम आणि मास स्पेक्ट्रोमेट्री परिणामांमधून (NIST 70 मानक डेटाबेसच्या संदर्भात) गणना केलेल्या क्षेत्र टक्केवारीच्या आधारावर प्रत्येक EO चे प्रमुख संयुगे ओळखले गेले.
प्रत्येक ईओमधील दोन प्रमुख संयुगे जीसी-एमएस निकालांच्या आधारे निवडण्यात आली आणि पुढील जैवचाचण्यांसाठी सिग्मा-अल्ड्रिचकडून ९८-९९% शुद्धतेमध्ये खरेदी करण्यात आली. वर वर्णन केल्याप्रमाणे, या संयुगांची एडीस इजिप्टीविरुद्ध अळीनाशक आणि प्रौढ डासांवरील परिणामकारकतेसाठी चाचणी घेण्यात आली. निवडलेल्या ईओ संयुगांशी त्यांच्या परिणामकारकतेची तुलना करण्यासाठी, त्याच प्रक्रियेनुसार, सर्वाधिक वापरले जाणारे कृत्रिम अळीनाशक टेमेफोसेट (सिग्मा अल्ड्रिच) आणि प्रौढ डासांवरील औषध मॅलाथिऑन (सिग्मा अल्ड्रिच) यांचे विश्लेषण करण्यात आले.
निवडक टर्पीन संयुगे आणि टर्पीन संयुगे अधिक व्यावसायिक ऑर्गनोफॉस्फेट्स (टाइलफॉस आणि मॅलाथिऑन) यांची द्विसंयुगे, प्रत्येक संभाव्य संयुगाचा LC50 डोस १:१ प्रमाणात मिसळून तयार करण्यात आली. तयार केलेल्या मिश्रणांची चाचणी, वर वर्णन केल्याप्रमाणे, एडीस इजिप्टीच्या अळी आणि प्रौढ अवस्थांवर करण्यात आली. प्रत्येक जैवचाचणी प्रत्येक मिश्रणासाठी तीन वेळा आणि प्रत्येक मिश्रणात असलेल्या स्वतंत्र संयुगांसाठी तीन वेळा करण्यात आली. २४ तासांनंतर लक्ष्य कीटकांच्या मृत्यूची नोंद घेण्यात आली. खालील सूत्राचा वापर करून द्विसंयुगासाठी अपेक्षित मृत्युदराची गणना करा.
येथे E = द्विसंयोजनाच्या प्रतिसादात एडीस इजिप्टी डासांचा अपेक्षित मृत्युदर, म्हणजेच संबंध (A + B).
पावला५२ यांनी वर्णन केलेल्या पद्धतीनुसार गणना केलेल्या χ² मूल्याच्या आधारावर प्रत्येक द्विमिश्रणाचा परिणाम सहक्रियात्मक, प्रतिरोधी किंवा कोणताही परिणाम नाही असे वर्गीकृत केले गेले. खालील सूत्र वापरून प्रत्येक संयोजनासाठी χ² मूल्याची गणना करा.
जेव्हा गणना केलेले χ2 मूल्य संबंधित डिग्री ऑफ फ्रीडमसाठी (९५% विश्वासार्हता अंतराल) सारणी मूल्यापेक्षा जास्त असते आणि निरीक्षण केलेला मृत्यूदर अपेक्षित मृत्यूदरापेक्षा जास्त आढळतो, तेव्हा त्या संयोजनाचा परिणाम सहक्रियात्मक (synergistic) मानला जातो. त्याचप्रमाणे, जर कोणत्याही संयोजनासाठी गणना केलेले χ2 मूल्य काही डिग्री ऑफ फ्रीडममध्ये सारणी मूल्यापेक्षा जास्त असेल, परंतु निरीक्षण केलेला मृत्यूदर अपेक्षित मृत्यूदरापेक्षा कमी असेल, तर तो उपचार प्रतिरोधी (antagonistic) मानला जातो. आणि जर कोणत्याही संयोजनामध्ये गणना केलेले χ2 मूल्य संबंधित डिग्री ऑफ फ्रीडममध्ये सारणी मूल्यापेक्षा कमी असेल, तर त्या संयोजनाचा कोणताही परिणाम होत नाही असे मानले जाते.
मोठ्या संख्येने कीटकांवर चाचणी करण्यासाठी तीन ते चार संभाव्य सहक्रियात्मक संयोग (१०० अळ्या आणि ५० प्रौढ कीटकांवरील अळीनाशक व प्रौढ कीटकांवरील क्रिया) निवडण्यात आले. चाचणी वरीलप्रमाणेच पुढे चालू राहिली. मिश्रणांसोबतच, निवडलेल्या मिश्रणांमध्ये उपस्थित असलेल्या वैयक्तिक संयुगांची देखील एडीस इजिप्टीच्या समान संख्येतील अळ्या आणि प्रौढ कीटकांवर चाचणी घेण्यात आली. संयोगाचे प्रमाण म्हणजे एका संभाव्य संयुगाचा LC50 डोस एक भाग आणि दुसऱ्या घटक संयुगाचा LC50 डोस असा आहे. प्रौढ कीटकांवरील क्रियेच्या जैवचाचणीमध्ये, निवडलेली संयुगे ॲसिटोन या द्रावकात विरघळवून १३०० घन सेमीच्या दंडगोलाकार प्लास्टिक कंटेनरमध्ये गुंडाळलेल्या फिल्टर पेपरवर लावली गेली. १० मिनिटांसाठी ॲसिटोनचे बाष्पीभवन केले गेले आणि प्रौढ कीटकांना सोडण्यात आले. त्याचप्रमाणे, अळीनाशक जैवचाचणीमध्ये, LC50 संभाव्य संयुगांचे डोस प्रथम DMSO च्या समान आकारमानात विरघळवून १३०० घन सेमीच्या प्लास्टिक कंटेनरमध्ये साठवलेल्या १ लिटर पाण्यात मिसळले गेले आणि अळ्यांना सोडण्यात आले.
LC50 मूल्यांची गणना करण्यासाठी SPSS (आवृत्ती 16) आणि Minitab सॉफ्टवेअर वापरून 71 नोंदवलेल्या मृत्यू डेटाचे संभाव्यता विश्लेषण केले गेले.