Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझरच्या आवृत्तीला मर्यादित CSS सपोर्ट आहे. सर्वोत्तम परिणामांसाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही तुमच्या ब्राउझरची नवीन आवृत्ती वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये कंपॅटिबिलिटी मोड अक्षम करा). दरम्यान, सतत सपोर्ट सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही स्टाइलिंग किंवा जावास्क्रिप्टशिवाय साइट दाखवत आहोत.
नैसर्गिक उत्पादनांचा शोध आणि फायदेशीर वापर मानवी जीवन सुधारण्यास मदत करू शकतो. तण नियंत्रणासाठी वनस्पतींच्या वाढीस प्रतिबंध करणारी रसायने मोठ्या प्रमाणात तणनाशक म्हणून वापरली जातात. विविध प्रकारच्या तणनाशकांचा वापर करण्याची गरज असल्याने, कृतीच्या नवीन यंत्रणेसह संयुगे ओळखण्याची आवश्यकता आहे. या अभ्यासात, आम्हाला स्ट्रेप्टोमायसेस वेरेन्सिस MK493-CF1 मधील एक नवीन N -alkoxypyrole संयुग, coumamonamide शोधले आणि संपूर्ण संश्लेषण प्रक्रिया स्थापित केली. जैविक क्रियाकलाप चाचण्यांद्वारे, आम्हाला आढळले की urs-monoamic acid हे urs-monoamide चे एक कृत्रिम मध्यवर्ती आहे आणि संभाव्यवनस्पती वाढ प्रतिबंधक. याव्यतिरिक्त, आम्ही विविध अर्बेनोनिक अॅसिड डेरिव्हेटिव्ह्ज विकसित केले आहेत, ज्यामध्ये अर्बेनिलॉक्सी डेरिव्हेटिव्ह (UDA) समाविष्ट आहे, ज्यामध्ये HeLa पेशींच्या वाढीवर नकारात्मक परिणाम न करता उच्च तणनाशक क्रिया असते. आम्हाला असेही आढळले की उर्मोटोनिक अॅसिड डेरिव्हेटिव्ह्ज वनस्पतींच्या सूक्ष्मनलिका विस्कळीत करतात; याव्यतिरिक्त, KAND अ‍ॅक्टिन फिलामेंट्सवर परिणाम करते आणि पेशी मृत्युला प्रवृत्त करते; हे बहुआयामी प्रभाव ज्ञात सूक्ष्मनलिका अवरोधकांपेक्षा वेगळे आहेत आणि उर्सोनिक अॅसिडसाठी कृतीची एक नवीन यंत्रणा सूचित करतात, जी नवीन तणनाशकांच्या विकासात एक महत्त्वाचा फायदा दर्शवते.
फायदेशीर नैसर्गिक उत्पादने आणि त्यांच्या डेरिव्हेटिव्ह्जचा शोध आणि व्यावहारिक वापर मानवी जीवनाची गुणवत्ता सुधारण्याचे एक साधन आहे. सूक्ष्मजीव, वनस्पती आणि कीटकांनी तयार केलेल्या दुय्यम चयापचयांमुळे औषध आणि शेतीमध्ये मोठी प्रगती झाली आहे. नैसर्गिक उत्पादनांपासून अनेक प्रतिजैविके आणि ल्युकेमियाविरोधी औषधे विकसित केली गेली आहेत. याव्यतिरिक्त, विविध प्रकारचेकीटकनाशकेया नैसर्गिक उत्पादनांमधून शेतीमध्ये वापरण्यासाठी बुरशीनाशके आणि तणनाशके काढली जातात. विशेषतः, आधुनिक शेतीमध्ये पीक उत्पादन वाढवण्यासाठी तण नियंत्रण तणनाशके ही महत्त्वाची साधने आहेत आणि विविध प्रकारची संयुगे आधीच व्यावसायिकरित्या वापरली जातात. वनस्पतींमध्ये प्रकाशसंश्लेषण, अमीनो आम्ल चयापचय, पेशी भिंतीचे संश्लेषण, मायटोसिसचे नियमन, फायटोहार्मोन सिग्नलिंग किंवा प्रथिने संश्लेषण यासारख्या अनेक पेशीय प्रक्रिया तणनाशकांचे वैशिष्ट्यपूर्ण लक्ष्य मानल्या जातात. सूक्ष्मनलिका कार्य रोखणारी संयुगे ही तणनाशकांचा एक सामान्य वर्ग आहे जी मायटोटिक नियमन2 वर परिणाम करून वनस्पतींच्या वाढीवर परिणाम करते.
मायक्रोट्यूब्यूल्स हे सायटोस्केलेटनचे घटक आहेत आणि युकेरियोटिक पेशींमध्ये मोठ्या प्रमाणात संरक्षित केले जातात. ट्यूब्युलिन हेटेरोडायमरमध्ये α-ट्यूब्युलिन आणि β-ट्यूब्युलिन असतात जे रेषीय मायक्रोट्यूब्यूल प्रोटोफिलामेंट्स बनवतात, ज्यामध्ये 13 प्रोटोफिलामेंट्स एक दंडगोलाकार रचना बनवतात. मायक्रोट्यूब्यूल्स वनस्पती पेशींमध्ये अनेक भूमिका बजावतात, ज्यामध्ये पेशींचा आकार निश्चित करणे, पेशी विभाजन आणि पेशीच्या आत वाहतूक समाविष्ट आहे3,4. वनस्पती पेशींमध्ये इंटरफेस प्लाझ्मा झिल्लीच्या खाली मायक्रोट्यूब्यूल्स असतात आणि हे तथाकथित कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्स सेल्युलोज सिंथेस कॉम्प्लेक्सच्या नियमनद्वारे सेल्युलोज मायक्रोफायब्रिल्सच्या संघटनेवर नियंत्रण ठेवतात असे मानले जाते4,5. मुळांच्या टोकाच्या जलद लांबीच्या क्षेत्रात असलेल्या मूळ एपिडर्मल पेशींचे कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्स बाजूच्या बाजूला स्थित असतात आणि सेल्युलोज मायक्रोफायबर्स या मायक्रोट्यूब्यूल्सचे अनुसरण करतात आणि पेशींच्या विस्ताराची दिशा मर्यादित करतात, ज्यामुळे अॅनिसोट्रॉपिक पेशींच्या लांबीला प्रोत्साहन मिळते. म्हणून, मायक्रोट्यूब्यूलचे कार्य वनस्पती आकारविज्ञानाशी जवळून संबंधित आहे. अरेबिडोप्सिस 6,7 मध्ये ट्युब्युलिन एन्कोड करणाऱ्या जीन्समधील अमीनो अॅसिड प्रतिस्थापन कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल अॅरेमध्ये विसंगती आणि डाव्या किंवा उजव्या बाजूची वाढ घडवून आणतात. त्याचप्रमाणे, मायक्रोट्यूब्यूल गतिशीलतेचे नियमन करणाऱ्या मायक्रोट्यूब्यूलशी संबंधित प्रथिनांमधील उत्परिवर्तन देखील मुळांच्या वाढीस विकृत करू शकतात8,9,10,11,12,13. याव्यतिरिक्त, डिस्ओपायरामाइड, ज्याला प्रीटिलाक्लोर असेही म्हणतात, सारख्या मायक्रोट्यूब्यूल-विघटनकारी तणनाशकांसह उपचार केल्याने देखील डाव्या बाजूची तिरकी मुळांची वाढ होते14. हे डेटा सूचित करतात की वनस्पतींच्या वाढीची दिशा निश्चित करण्यासाठी मायक्रोट्यूब्यूल कार्याचे अचूक नियमन महत्त्वपूर्ण आहे.
विविध प्रकारचे मायक्रोट्यूब्यूल इनहिबिटर शोधले गेले आहेत आणि या औषधांनी सायटोस्केलेटल संशोधनात तसेच शेती आणि औषधांमध्ये महत्त्वपूर्ण योगदान दिले आहे. विशेषतः, ऑरिझालिन, डायनिट्रोअॅनिलिन संयुगे, डिसोपायरामाइड, बेंझामाइड-संबंधित संयुगे आणि त्यांचे अॅनालॉग मायक्रोट्यूब्यूलचे कार्य रोखू शकतात आणि त्यामुळे वनस्पतींची वाढ रोखू शकतात. म्हणून, ते मोठ्या प्रमाणावर तणनाशक म्हणून वापरले जातात. तथापि, मायक्रोट्यूब्यूल हे वनस्पती आणि प्राण्यांच्या पेशींचा एक महत्त्वाचा घटक असल्याने, बहुतेक मायक्रोट्यूब्यूल इनहिबिटर दोन्ही प्रकारच्या पेशींसाठी सायटोटॉक्सिक असतात. म्हणून, तणनाशक म्हणून त्यांची उपयुक्तता ओळखली जात असूनही, व्यावहारिक हेतूंसाठी मर्यादित संख्येने अँटीमायक्रोट्यूब्यूल एजंट वापरले जातात.
स्ट्रेप्टोमायसेस ही स्ट्रेप्टोमायसेस कुटुंबातील एक प्रजाती आहे, ज्यामध्ये एरोबिक, ग्राम-पॉझिटिव्ह, फिलामेंटस बॅक्टेरिया समाविष्ट आहेत आणि ते विविध प्रकारच्या दुय्यम चयापचयांची निर्मिती करण्याच्या क्षमतेसाठी व्यापकपणे ओळखले जाते. म्हणूनच, ते नवीन जैविक दृष्ट्या सक्रिय नैसर्गिक उत्पादनांच्या सर्वात महत्वाच्या स्त्रोतांपैकी एक मानले जाते. सध्याच्या अभ्यासात, आम्हाला कौमामोनामाइड नावाचे एक नवीन संयुग सापडले, जे स्ट्रेप्टोमायसेस वेरेन्सिस MK493-CF1 आणि S. वेरेन्सिस ISP 5486 पासून वेगळे केले गेले होते. वर्णक्रमीय विश्लेषण आणि पूर्ण वर्णक्रमीय विश्लेषण वापरून, कौमामोनामाइडची रचना वैशिष्ट्यीकृत केली गेली आणि त्याचे अद्वितीय N-अल्कोक्सीपायरोल सांगाडा निश्चित केले गेले. संश्लेषण. उर्समोनोमाइड आणि त्याच्या डेरिव्हेटिव्ह्जचे कृत्रिम मध्यवर्ती उर्समोनिक ऍसिड, लोकप्रिय मॉडेल वनस्पती अरेबिडोप्सिस थालियानाची वाढ आणि उगवण रोखत असल्याचे आढळले. स्ट्रक्चर-अ‍ॅक्टिव्हिटी रिलेशनशिप अभ्यासात, आम्हाला आढळले की C9 असलेले संयुग, ज्याला नॉनिलॉक्सी डेरिव्हेटिव्ह ऑफ उर्सोनिक ऍसिड (KAND) म्हणतात, वाढ आणि उगवणावरील प्रतिबंधात्मक प्रभाव लक्षणीयरीत्या वाढवते. विशेष म्हणजे, नव्याने शोधलेल्या वनस्पती वाढीच्या अवरोधकाने तंबाखू आणि लिव्हरवॉर्टच्या वाढीवर देखील परिणाम केला आणि तो बॅक्टेरिया किंवा HeLa पेशींसाठी सायटोटॉक्सिक नव्हता. शिवाय, काही उर्मोटोनिक अॅसिड डेरिव्हेटिव्ह्ज मूळ फेनोटाइपमध्ये विकृतता निर्माण करतात, याचा अर्थ असा होतो की हे डेरिव्हेटिव्ह्ज थेट किंवा अप्रत्यक्षपणे सूक्ष्मनलिका प्रभावित करतात. या कल्पनेशी सुसंगत, इम्युनोहिस्टोकेमिकली किंवा फ्लोरोसेंट प्रथिनांसह लेबल केलेल्या सूक्ष्मनलिकांवरील आमच्या निरीक्षणांवरून असे दिसून येते की KAND उपचार सूक्ष्मनलिका डिपॉलिमराइज करतात. याव्यतिरिक्त, कुमामोटोनिक अॅसिड डेरिव्हेटिव्ह्जसह उपचार केल्याने अ‍ॅक्टिन मायक्रोफिलामेंट्समध्ये व्यत्यय येतो. अशाप्रकारे, आम्हाला एक नवीन वनस्पती वाढ अवरोधक सापडला आहे ज्याच्या कृतीची अद्वितीय यंत्रणा सायटोस्केलेटन नष्ट करणे समाविष्ट आहे.
टोकियोतील शिनागावा-कु येथील मातीपासून MK493-CF1 या जातीचे वेगळेपण करण्यात आले. MK493-CF1 या जातीने चांगल्या फांद्या असलेला स्ट्रोमल मायसेलियम तयार केला. 16S राइबोसोमल आरएनए जनुकाचा आंशिक क्रम (1422 bp) निश्चित करण्यात आला. हा जाती S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: सामान्य जाती, 99.93%) सारखाच आहे. या निकालाच्या आधारे, हे निश्चित करण्यात आले की हा जाती S. werraensis च्या प्रकारच्या जातीशी जवळून संबंधित आहे. म्हणून, आम्ही या जातीला तात्पुरते S. werraensis MK493-CF1 असे नाव दिले. S. werraensis ISP 5486T देखील समान जैव सक्रिय संयुगे तयार करते. या सूक्ष्मजीवापासून नैसर्गिक उत्पादने मिळविण्यासाठी सुरुवातीच्या काळात फारसे संशोधन झाले नसल्याने, पुढील रासायनिक संशोधन करण्यात आले. S. werraensis MK493-CF1 ची लागवड बार्ली माध्यमावर 30°C वर घन-अवस्थेतील किण्वन करून 14 दिवसांपर्यंत केल्यानंतर, माध्यम 50% EtOH सह काढले गेले. 59.5 मिलीग्राम कच्चा अर्क मिळविण्यासाठी 60 मिली नमुना वाळवण्यात आला. N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, नाव कूमामोनामाइड, 36.0 मिलीग्राम) देण्यासाठी कच्चा अर्क रिव्हर्स फेज HPLC च्या अधीन करण्यात आला. 1 ची एकूण मात्रा कच्च्या अर्काच्या अंदाजे 60% आहे. म्हणून, आम्ही कुमामोटोअमाइड 1 च्या गुणधर्मांचा तपशीलवार अभ्यास करण्याचा निर्णय घेतला.
कौमामोनामाइड १ हा एक पांढरा अनाकार पावडर आहे आणि उच्च रिझोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HRESIMS) C6H8N2O2 ची पुष्टी करतो (आकृती १). या संयुगाचा C2-प्रतिस्थापन केलेला पायरोल तुकडा δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR स्पेक्ट्रममध्ये: 4.5 Hz, H-5) आणि δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) द्वारे दर्शविला जातो आणि 13C NMR स्पेक्ट्रम चार sp2 कार्बन अणूंची उपस्थिती दर्शवितो. C2 स्थानावर अमाइड गटाची उपस्थिती δC 161.1 वर C-3 प्रोटॉनपासून अमाइड कार्बोनिल कार्बनशी HMBC सहसंबंधाद्वारे मूल्यांकन केली गेली. याव्यतिरिक्त, δH 4.10 (3H, S) आणि δC 68.3 वर 1 H आणि 13 C NMR शिखर रेणूमध्ये N-मेथॉक्सी गटांची उपस्थिती दर्शवितात. जरी वर्धित फरक स्पेक्ट्रोस्कोपी आणि न्यूक्लियर ओव्हरहॉझर संक्षेप (NOEDF) सारख्या स्पेक्ट्रोस्कोपिक विश्लेषणाचा वापर करून मेथॉक्सी गटाची योग्य स्थिती अद्याप निश्चित केली गेली नसली तरी, N-मेथॉक्सी-1H-पायरोल-2-कार्बोक्सामाइड हे पहिले उमेदवार संयुग बनले.
१ ची योग्य रचना निश्चित करण्यासाठी, एकूण संश्लेषण करण्यात आले (आकृती २अ). व्यावसायिकरित्या उपलब्ध असलेल्या २-अमिनोपायरीडिन २ चे m-CPBA सह उपचार केल्याने संबंधित N-ऑक्साइड ३ चे परिमाणात्मक उत्पन्न मिळाले. २ च्या २-अमिनोपायरीडिनेशन नंतर, अब्रामोविचने वर्णन केलेली सायक्लोकंडेन्सेशन अभिक्रिया ९०°C वर बेंझिनमध्ये केली गेली जेणेकरून इच्छित १-हायड्रॉक्सी-१एच-पायरोल-२-कार्बोनिट्राइल ५ ग्रॅममध्ये मिळू शकेल. गती ६०% (दोन टप्पे). १५,१६. ४ चे मेथिलेशन आणि हायड्रोलिसिस नंतर १-मेथॉक्सी-१एच-पायरोल-२-कार्बोक्झिलिक आम्ल ("क्युमोटोनिक आम्ल", ६ असे म्हणतात) चांगले उत्पन्न (७०%, दोन टप्पे) दिले. शेवटी, जलीय अमोनिया वापरून आम्ल क्लोराइड इंटरमीडिएट ६ द्वारे अमिडेशन केल्याने कुमामोटो अमाइड १ मध्ये ९८% उत्पन्न मिळाले. संश्लेषित १ चा सर्व वर्णक्रमीय डेटा वेगळ्या १ सारखाच होता, म्हणून १ ची रचना निश्चित केली गेली;
अर्बेनामाइड आणि अर्बेनिक आम्लाच्या जैविक क्रियेचे सामान्य संश्लेषण आणि विश्लेषण. (अ) कुमामोटो अमाइडचे एकूण संश्लेषण. (ब) सात दिवस जुनी जंगली प्रकारची अरबीडोप्सिस कोलंबिया (कोल) रोपे मुराशिगे आणि स्कूग (एमएस) प्लेट्सवर दर्शविलेल्या सांद्रतेवर वाढवली गेली ज्यात कौमामोनामाइड 6 किंवा कौमामोनामाइड 1 होते. स्केल बार = 1 सेमी.
प्रथम, आम्ही वनस्पतींच्या वाढीचे नियमन करण्याच्या क्षमतेसाठी अर्बेनामाइड आणि त्याच्या मध्यस्थांच्या जैविक क्रियाकलापांचे मूल्यांकन केले. आम्ही एमएस अगर माध्यमात उर्समोनामाइड 1 किंवा उर्समोनिक अॅसिड 6 चे विविध सांद्रता जोडले आणि या माध्यमावर अरबीडोप्सिस थालियाना रोपे संवर्धित केली. या चाचण्यांमधून असे दिसून आले की 6 ची उच्च सांद्रता (500 μM) मुळांच्या वाढीस प्रतिबंध करते (आकृती 2b). पुढे, आम्ही 6 ची N1 स्थिती बदलून विविध डेरिव्हेटिव्ह्ज तयार केले आणि त्यांच्यावर संरचना-क्रियाकलाप संबंध अभ्यास केले (अॅनालॉग संश्लेषण प्रक्रिया सहाय्यक माहिती (SI) मध्ये वर्णन केली आहे). अरबीडोप्सिस रोपे 50 μM उर्सोनिक अॅसिड डेरिव्हेटिव्ह्ज असलेल्या माध्यमावर वाढवली गेली आणि मुळांची लांबी मोजली गेली. जसे चित्रात दाखवले आहे. आकृती 3a, b आणि S1 मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, कौमामो आम्लांमध्ये N1 स्थानावर रेषीय अल्कोक्सी साखळ्या (9, 10, 11, 12 आणि 13) किंवा मोठ्या अल्कोक्सी साखळ्या (15, 16 आणि 17) वेगवेगळ्या लांबीच्या असतात. डेरिव्हेटिव्ह्जने मुळांच्या वाढीस लक्षणीय अडथळा दर्शविला. याव्यतिरिक्त, आम्हाला आढळले की 200 μM 10, 11 किंवा 17 च्या वापरामुळे उगवण रोखली जाते (आकृती 3c आणि S2).
कुमामोटो अमाइड आणि संबंधित संयुगांच्या रचना-क्रियाकलाप संबंधांचा अभ्यास. (अ) अॅनालॉग्सची रचना आणि संश्लेषण योजना. (ब) ५० μM कौमामोनामाइड डेरिव्हेटिव्ह्जसह किंवा त्याशिवाय एमएस माध्यमावर वाढवलेल्या ७ दिवसांच्या रोपांच्या मुळांच्या लांबीचे परिमाण. तारांकने बनावट उपचारांसह महत्त्वपूर्ण फरक दर्शवतात (टी चाचणी, पी< ०.०५). n>१८. डेटा सरासरी ± SD म्हणून दाखवला आहे. nt म्हणजे "चाचणी न केलेले" कारण ५०% पेक्षा जास्त बियाणे अंकुरलेले नाहीत. (c) २०० μM कौमामोनामाइड आणि संबंधित संयुगांसह किंवा त्याशिवाय MS माध्यमात ७ दिवस उबवलेल्या प्रक्रिया केलेल्या बियाण्यांच्या उगवण दराचे परिमाण. तारांकने बनावट उपचारांसह (ची-स्क्वेअर चाचणी) लक्षणीय फरक दर्शवतात. n=९६.
मनोरंजक गोष्ट म्हणजे, C9 पेक्षा जास्त लांबीच्या अल्काइल साइड चेन जोडल्याने प्रतिबंधात्मक क्रियाकलाप कमी झाला, ज्यामुळे असे सूचित होते की कुमामोटोइक अॅसिडशी संबंधित संयुगांना त्यांच्या जैविक क्रियाकलाप प्रदर्शित करण्यासाठी विशिष्ट आकाराच्या साइड चेनची आवश्यकता असते.
रचना-क्रियाकलाप संबंध विश्लेषणातून असे दिसून आले की C9 ला उर्सोनिक आम्लात बदलण्यात आले होते आणि उर्सोनिक आम्लाचे नॉनिलॉक्सी व्युत्पन्न (यापुढे KAND 11 म्हणून संदर्भित) हे सर्वात प्रभावी वनस्पती वाढ प्रतिबंधक होते, आम्ही KAND 11 चे अधिक तपशीलवार वर्णन केले. 50 μM KAND 11 सह अरबीडोप्सिसच्या उपचाराने उगवण जवळजवळ पूर्णपणे रोखली, तर KAND 11 च्या कमी सांद्रता (40, 30, 20, किंवा 10 μM) ने डोस-आश्रित पद्धतीने मुळांची वाढ रोखली (आकृती 4a, b). KAND 11 मुळांच्या मेरिस्टेम व्यवहार्यतेवर परिणाम करते का हे तपासण्यासाठी, आम्ही प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) ने रंगवलेले मूळ मेरिस्टेम तपासले आणि मेरिस्टेम क्षेत्राचा आकार मोजला. २५ μM KAND-11 असलेल्या माध्यमावर वाढवलेल्या रोपांच्या मेरिस्टेमचा आकार १५१.१ ± ३२.५ μm होता, तर DMSO असलेल्या नियंत्रण माध्यमावर वाढवलेल्या रोपांच्या मेरिस्टेमचा आकार २६४.७ ± ३०.८ μm होता (आकृती ४c, d), जे दर्शवते की KAND-11 पेशीय क्रियाकलाप पुनर्संचयित करते. प्रसार. रूट मेरिस्टेम. याच्याशी सुसंगत, KAND 11 उपचाराने रूट मेरिस्टेममध्ये पेशी विभाजन मार्कर CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS सिग्नलचे प्रमाण कमी केले (आकृती ४e) १७. हे परिणाम सूचित करतात की KAND 11 पेशी प्रसार क्रियाकलाप कमी करून मुळांच्या वाढीस प्रतिबंध करते.
वाढीवरील अर्बेनोनिक अॅसिड डेरिव्हेटिव्ह्ज (अरबेनिलॉक्सी डेरिव्हेटिव्ह्ज) च्या प्रतिबंधात्मक परिणामाचे विश्लेषण. (अ) KAND ११ च्या दर्शविलेल्या सांद्रतेसह MS प्लेट्सवर वाढवलेली ७ दिवसांची वन्य-प्रकारची कोलन रोपे. स्केल बार = १ सेमी. (ब) मुळांच्या लांबीचे परिमाण. अक्षरे लक्षणीय फरक दर्शवतात (टुकी एचएसडी चाचणी, पी< ०.०५). n>१६. डेटा सरासरी ± SD म्हणून दाखवला आहे. (c) २५ μM KAND असलेल्या किंवा त्याशिवाय MS प्लेट्सवर वाढलेल्या प्रोपिडियम आयोडाइड-स्टेन्ड वाइल्ड-टाइप कोलन मुळांची कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपी ११. पांढरे कंस रूट मेरिस्टेम दर्शवितात. स्केल बार = १०० µm. (d) रूट मेरिस्टेम आकाराचे परिमाण (n = १० ते ११). टी-टेस्ट वापरून सांख्यिकीय फरक निश्चित केले गेले (p< ०.०५). बार सरासरी मेरिस्टेम आकार दर्शवतात. (ई) CDKB2 रचना असलेल्या रूट मेरिस्टेमची डिफरेंशियल इंटरफेरन्स कॉन्ट्रास्ट (DIC) मायक्रोस्कोपी; 1pro: CDKB2; 25 µM KAND परख असलेल्या किंवा त्याशिवाय MS प्लेट्सवर उगवलेल्या 5 दिवसांच्या रोपांवर 1-GUS रंगवलेले आणि रंगवलेले.
KAND 11 ची फायटोटॉक्सिसिटी आणखी एका द्विदल वनस्पती, तंबाखू (निकोटियाना टॅबॅकम) आणि एक प्रमुख जमिनीवरील वनस्पती मॉडेल जीव, लिव्हरवॉर्ट (मार्चेंटिया पॉलीमॉर्फा) वापरून तपासण्यात आली. अरबीडोप्सिसच्या बाबतीत, 25 μM KAND 11 असलेल्या माध्यमावर उगवलेल्या तंबाखू SR-1 रोपांनी लहान मुळे तयार केली (आकृती 5a). याव्यतिरिक्त, 48 पैकी 40 बिया 200 μM KAND 11 असलेल्या प्लेट्सवर अंकुरित झाल्या, तर सर्व 48 बिया मॉक-ट्रीटेड मीडियावर अंकुरित झाल्या, जे दर्शवते की KAND ची उच्च सांद्रता लक्षणीय होती (p< ०.०५; ची टेस्ट -स्क्वेअर) ने तंबाखूची उगवण रोखली. (आकृती ५ब). याव्यतिरिक्त, लिव्हरवॉर्टमध्ये बॅक्टेरियाच्या वाढीस प्रतिबंध करणाऱ्या KAND ११ ची सांद्रता अरबीडोप्सिस (आकृती ५क) मधील प्रभावी सांद्रता सारखीच होती. हे निकाल दर्शवतात की KAND ११ विविध वनस्पतींच्या वाढीस प्रतिबंध करू शकते. त्यानंतर आम्ही इतर जीवांमध्ये, म्हणजे मानवी HeLa पेशी आणि एस्चेरिचिया कोलाई स्ट्रेन DH5α, उच्च प्राणी आणि बॅक्टेरिया पेशींचे प्रतिनिधी म्हणून अस्वल मोनोअमाइड-संबंधित संयुगांच्या संभाव्य सायटोटॉक्सिसिटीची तपासणी केली. पेशी प्रसार चाचण्यांच्या मालिकेत, आम्ही पाहिले की कूमामोनामाइड १, कूमामोनामाइडिक ऍसिड ६ आणि KAND ११ ने १०० μM च्या सांद्रतेवर HeLa किंवा E. coli पेशींच्या वाढीवर परिणाम केला नाही (आकृती ५ड,ई).
नॉन-अराबिडोप्सिस जीवांमध्ये KAND 11 चा वाढीचा प्रतिबंध. (a) दोन आठवड्यांची वन्य-प्रकार SR-1 तंबाखूची रोपे 25 μM KAND 11 असलेल्या उभ्या स्थितीत असलेल्या MS प्लेट्सवर वाढवली गेली. (b) दोन आठवड्यांची वन्य-प्रकार SR-1 तंबाखूची रोपे 200 μM KAND 11 असलेल्या क्षैतिज स्थितीत असलेल्या MS प्लेट्सवर वाढवली गेली. (c) KAND 11 च्या दर्शविलेल्या सांद्रतेसह गॅम्बोर्ग B5 प्लेट्सवर वाढवलेल्या दोन आठवड्यांच्या वन्य-प्रकार Tak-1 लिव्हरवॉर्ट कळ्या. लाल बाण दोन आठवड्यांच्या उष्मायन कालावधीत वाढणे थांबविणारे बीजाणू दर्शवतात. (d) HeLa पेशींचे पेशी प्रसार परीक्षण. पेशी गणना किट 8 (Dojindo) वापरून निश्चित वेळेच्या अंतराने व्यवहार्य पेशींची संख्या मोजली गेली. नियंत्रण म्हणून, HeLa पेशींवर 5 μg/ml अ‍ॅक्टिनोमायसिन D (अ‍ॅक्ट D) ने उपचार केले गेले, जे RNA पॉलिमरेज ट्रान्सक्रिप्शनला प्रतिबंधित करते आणि पेशी मृत्यूला कारणीभूत ठरते. विश्लेषणे तिप्पट मध्ये केली गेली. (e) E. कोलाई पेशी प्रसार परीक्षण. OD600 मोजून ई. कोलाईच्या वाढीचे विश्लेषण करण्यात आले. नियंत्रण म्हणून, पेशींवर 50 μg/ml अँपिसिलिन (Amp) उपचार करण्यात आले, जे बॅक्टेरियाच्या पेशी भिंतीच्या संश्लेषणाला प्रतिबंधित करते. विश्लेषणे तीन प्रतींमध्ये करण्यात आली.
युरामाइड-संबंधित संयुगांमुळे होणाऱ्या सायटोटॉक्सिसिटीच्या कृतीची यंत्रणा समजून घेण्यासाठी, आम्ही मध्यम प्रतिबंधात्मक प्रभावांसह अर्बेनिक अॅसिड डेरिव्हेटिव्ह्जचे पुनर्विश्लेषण केले. जसे ते चित्रात दाखवले आहे. आकृती 2b, 6a मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, उर्मोटोनिक अॅसिड 6 च्या उच्च सांद्रता (200 μM) असलेल्या आगर प्लेट्सवर वाढवलेल्या रोपांनी लहान आणि डाव्या-वक्र मुळे (θ = – 23.7 ± 6.1) तयार केली, तर नियंत्रण माध्यमावर वाढवलेल्या रोपांनी जवळजवळ सरळ मुळे (θ = – 3.8 ± 7.1) तयार केली. ही वैशिष्ट्यपूर्ण तिरकी वाढ कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्सच्या बिघडलेल्या कार्यामुळे होते हे ज्ञात आहे14,18. या निष्कर्षाशी सुसंगत, मायक्रोट्यूब्यूल-अस्थिर करणारी औषधे डिसोपायरामाइड आणि ओरिझालिन यांनी आमच्या वाढीच्या परिस्थितीत समान मुळांना झुकण्यास प्रेरित केले (आकृती 2b, 6a). त्याच वेळी, आम्ही उर्मोटोनिक अॅसिड डेरिव्हेटिव्ह्जची चाचणी केली आणि त्यापैकी अनेक निवडले जे विशिष्ट सांद्रतेवर, तिरकी मुळांची वाढ प्रेरित करतात. संयुगे ८, ९ आणि १५ ने अनुक्रमे ७५ μM, ५० μM आणि ४० μM वर मुळांच्या वाढीची दिशा बदलली, हे दर्शविते की ही संयुगे सूक्ष्मनलिका प्रभावीपणे अस्थिर करू शकतात (आकृती २b, ६a). आम्ही सर्वात शक्तिशाली उर्सोलिक आम्ल डेरिव्हेटिव्ह, KAND ११, कमी एकाग्रतेवर (१५ μM) देखील चाचणी केली आणि आढळले की KAND ११ चा वापर मुळांच्या वाढीस प्रतिबंध करतो आणि मुळांच्या वाढीची दिशा असमान होती, जरी ते डावीकडे झुकत होते (आकृती C3). . सूक्ष्मनलिका-अस्थिर करणाऱ्या औषधांच्या उच्च सांद्रतेमुळे कधीकधी मुळांना झुकवण्याऐवजी वनस्पतींच्या वाढीस प्रतिबंध होतो, म्हणून आम्ही नंतर मुळांच्या बाह्यत्वच्या पेशींमध्ये कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिका निरीक्षण करून KAND ११ सूक्ष्मनलिका प्रभावित करते याची शक्यता मूल्यांकन केली. २५ μM KAND 11 ने उपचार केलेल्या रोपांच्या मुळांच्या एपिडर्मल पेशींमध्ये अँटी-β-ट्यूब्युलिन अँटीबॉडीज वापरून केलेल्या इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्रीमध्ये एलोंगेशन झोनमधील एपिडर्मल पेशींमधील जवळजवळ सर्व कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्स गायब झाल्याचे दिसून आले (आकृती 6b). हे निकाल दर्शवितात की कुमामोटोनिक आम्ल आणि त्याचे डेरिव्हेटिव्ह्ज मायक्रोट्यूब्यूल्सवर थेट किंवा अप्रत्यक्षपणे कार्य करतात आणि त्यांना व्यत्यय आणतात आणि ही संयुगे नवीन मायक्रोट्यूब्यूल इनहिबिटर आहेत.
अर्बिडोप्सिस थालियानामध्ये उर्सोनिक आम्ल आणि त्याचे डेरिव्हेटिव्ह्ज कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्समध्ये बदल करतात. (अ) दर्शविलेल्या सांद्रतेवर विविध उर्मोटोनिक आम्ल डेरिव्हेटिव्ह्जच्या उपस्थितीत मोजलेले मुळांचा झुकाव कोन. सूक्ष्मट्यूब्यूल्सना प्रतिबंधित करण्यासाठी ज्ञात असलेल्या दोन संयुगांचे परिणाम: डिसोपायरामाइड आणि ओरिझालिन यांचे देखील विश्लेषण केले गेले. इनसेट मुळांच्या वाढीचा कोन मोजण्यासाठी वापरले जाणारे मानक दर्शविते. तारका बनावट उपचारांसह महत्त्वपूर्ण फरक दर्शवितात (टी चाचणी, पी< ०.०५). n>१९. स्केल बार = १ सेमी. (ब) विस्तार झोनमधील एपिडर्मल पेशींमध्ये कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्स. २५ μM KAND ११ सह किंवा त्याशिवाय MS प्लेट्सवर वाढलेल्या वन्य-प्रकारच्या अरेबिडोप्सिस कोल रूट्समधील मायक्रोट्यूब्यूल्स β-ट्यूब्युलिन प्राथमिक अँटीबॉडीज आणि अलेक्सा फ्लोर-कंजुगेटेड दुय्यम अँटीबॉडीज वापरून इम्युनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंगद्वारे दृश्यमान केले गेले. स्केल बार = १० µm. (क) रूट मेरिस्टेममधील मायक्रोट्यूब्यूल्सची मायटोटिक रचना. इम्युनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग वापरून मायक्रोट्यूब्यूल्स दृश्यमान केले गेले. प्रोफेस झोन, स्पिंडल्स आणि फ्रॅगमोप्लास्टसह मायटोटिक संरचना, कॉन्फोकल प्रतिमांमधून मोजल्या गेल्या. बाण मायटोटिक मायक्रोट्यूब्यूल संरचना दर्शवतात. तारका शेम ट्रीटमेंटसह महत्त्वपूर्ण फरक दर्शवतात (टी चाचणी, पी< ०.०५). n>९. स्केल बार = ५० µm.
जरी उर्सामध्ये मायक्रोट्यूब्यूल फंक्शनमध्ये व्यत्यय आणण्याची क्षमता असली तरी, त्याची कृती करण्याची यंत्रणा सामान्य मायक्रोट्यूब्यूल डिपॉलिमरायझिंग एजंट्सपेक्षा वेगळी असण्याची अपेक्षा आहे. उदाहरणार्थ, डिसोपायरामाइड आणि ओरिझालिन सारख्या मायक्रोट्यूब्यूल डिपॉलिमरायझिंग एजंट्सच्या उच्च सांद्रतेमुळे एपिडर्मल पेशींचा अॅनिसोट्रॉपिक विस्तार होतो, तर KAND 11 तसे करत नाही. याव्यतिरिक्त, KAND 11 आणि डिसोपायरामाइडच्या सह-अनुप्रयोगामुळे डिसोपायरामाइड-प्रेरित मुळांच्या वाढीचा प्रतिसाद आणि KAND 11-प्रेरित वाढ प्रतिबंध दिसून आला (आकृती S4). आम्ही अतिसंवेदनशील डिसोपायरामाइड 1-1 (phs1-1) उत्परिवर्तनाचा KAND 11 ला प्रतिसाद देखील विश्लेषण केला. phs1-1 मध्ये नॉन-कॅनोनिकल ट्यूबुलिन काइनेज पॉइंट उत्परिवर्तन आहे आणि डिसोपायरामाइडने उपचार केल्यावर ते लहान मुळे तयार करतात9,20. KAND 11 असलेल्या अगर माध्यमावर उगवलेल्या phs1-1 उत्परिवर्तन रोपांची मुळे डिसोपायरामिडवर उगवलेल्या रोपांसारखीच लहान होती (आकृती S5).
याव्यतिरिक्त, KAND 11 ने उपचार केलेल्या रोपांच्या मुळांच्या मेरिस्टेममध्ये आम्हाला प्रोफेस झोन, स्पिंडल्स आणि फ्रॅगमोप्लास्ट सारख्या मायटोटिक मायक्रोट्यूब्यूल संरचना आढळल्या. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS च्या निरीक्षणांशी सुसंगत, मायटोटिक मायक्रोट्यूब्यूलच्या संख्येत लक्षणीय घट दिसून आली (आकृती .6c).
सबसेल्युलर रिझोल्यूशनवर KAND 11 च्या सायटोटॉक्सिसिटीचे वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी, आम्ही KAND 11 सह तंबाखू BY-2 सस्पेंशन पेशींवर उपचार केले आणि त्यांचा प्रतिसाद पाहिला. कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्सवर KAND 11 चा प्रभाव मूल्यांकन करण्यासाठी आम्ही प्रथम TagRFP-TUA6 व्यक्त करणाऱ्या BY-2 पेशींमध्ये KAND 11 जोडले, जे फ्लोरोसेंटली मायक्रोट्यूब्यूल्स लेबल करते. कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल घनतेचे मूल्यांकन प्रतिमा विश्लेषण वापरून केले गेले, ज्याने सायटोप्लाज्मिक पिक्सेलमध्ये सायटोस्केलेटल पिक्सेलची टक्केवारी मोजली. परख निकालांवरून असे दिसून आले की 50 μM किंवा 100 μM KAND 11 सह 1 तास उपचार केल्यानंतर, घनता अनुक्रमे 0.94 ± 0.74% किंवा 0.23 ± 0.28% पर्यंत लक्षणीयरीत्या कमी झाली, तर DMSO सह उपचार केलेल्या पेशींची घनता 1.61 ± 0.34% (आकृती 7a) इतकी होती. हे निकाल अरेबिडोप्सिसमधील निरीक्षणाशी सुसंगत आहेत की KAND 11 उपचारामुळे कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्सचे डिपॉलिमरायझेशन होते (आकृती 6b). आम्ही KAND 11 च्या समान एकाग्रतेसह उपचारानंतर GFP-ABD-लेबल केलेल्या अ‍ॅक्टिन फिलामेंट्ससह BY-2 लाइनचे देखील परीक्षण केले आणि असे आढळून आले की KAND 11 उपचाराने अ‍ॅक्टिन फिलामेंट्समध्ये व्यत्यय आणला. 50 μM किंवा 100 μM KAND 11 सह 1 तासासाठी उपचार केल्याने अ‍ॅक्टिन फिलामेंटची घनता अनुक्रमे 1.20 ± 0.62% किंवा 0.61 ± 0.26% पर्यंत लक्षणीयरीत्या कमी झाली, तर DMSO-उपचारित पेशींमध्ये घनता 1.69 ± 0.51% होती (आकृती 2). 7b). हे निकाल प्रोपिझामाइडच्या प्रभावांशी विरोधाभासी आहेत, जे अ‍ॅक्टिन फिलामेंट्सवर परिणाम करत नाही आणि लॅट्रनकुलिन B, एक अ‍ॅक्टिन डिपॉलिमरायझर जे मायक्रोट्यूब्यूल्सवर परिणाम करत नाही (SI आकृती S6). याव्यतिरिक्त, कौमामोनामाइड १, कौमामोनामाइड अॅसिड ६, किंवा केएएनडी ११ सह उपचार केल्याने हेला पेशींमधील सूक्ष्मनलिका प्रभावित झाल्या नाहीत (एसआय आकृती एस७). अशाप्रकारे, केएएनडी ११ च्या कृतीची यंत्रणा ज्ञात सायटोस्केलेटन डिसप्टर्सपेक्षा वेगळी असल्याचे मानले जाते. याव्यतिरिक्त, केएएनडी ११ सह उपचार केलेल्या बीवाय-२ पेशींच्या आमच्या सूक्ष्म निरीक्षणातून केएएनडी ११ उपचारादरम्यान पेशी मृत्यूची सुरुवात दिसून आली आणि असे दिसून आले की केएएनडी ११ उपचाराच्या ३० मिनिटांनंतर इव्हान्स निळ्या रंगाच्या मृत पेशींचे प्रमाण लक्षणीयरीत्या वाढले नाही, तर ५० μM किंवा १०० μM केएएनडी सह ९० मिनिटांच्या उपचारानंतर, मृत पेशींची संख्या अनुक्रमे ४३.७% किंवा ८०.१% पर्यंत वाढली (आकृती ७क). एकत्रितपणे, हे डेटा सूचित करतात की नवीन उर्सोलिक अॅसिड डेरिव्हेटिव्ह केएएनडी ११ ही वनस्पती-विशिष्ट सायटोस्केलेटल इनहिबिटर आहे ज्याची कृतीची यंत्रणा पूर्वी अज्ञात होती.
KAND कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्स, अ‍ॅक्टिन फिलामेंट्स आणि तंबाखू BY-2 पेशींच्या व्यवहार्यतेवर परिणाम करते. (a) TagRFP-TUA6 च्या उपस्थितीत BY-2 पेशींमध्ये कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्सचे दृश्यमानीकरण. KAND 11 (50 μM किंवा 100 μM) किंवा DMSO ने उपचार केलेल्या BY-2 पेशींची कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपीद्वारे तपासणी केली गेली. 25 स्वतंत्र पेशींच्या मायक्रोग्राफवरून कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल घनता मोजली गेली. अक्षरे लक्षणीय फरक दर्शवतात (टुकी HSD चाचणी, p< ०.०५). स्केल बार = १० µm. (ब) GFP-ABD2 च्या उपस्थितीत दृश्यमान BY-2 पेशींमधील कॉर्टिकल अ‍ॅक्टिन फिलामेंट्स. KAND 11 (50 μM किंवा 100 μM) किंवा DMSO ने उपचारित BY-2 पेशींची कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपीद्वारे तपासणी करण्यात आली. कॉर्टिकल अ‍ॅक्टिन फिलामेंट्सची घनता २५ स्वतंत्र पेशींच्या मायक्रोग्राफवरून मोजण्यात आली. अक्षरे लक्षणीय फरक दर्शवतात (टुकी एचएसडी चाचणी, पी< ०.०५). स्केल बार = १० µm. (c) इव्हान्स ब्लू स्टेनिंगद्वारे मृत BY-2 पेशींचे निरीक्षण. KAND 11 (50 μM किंवा 100 μM) किंवा DMSO ने उपचार केलेल्या BY-2 पेशींची ब्राइट-फील्ड मायक्रोस्कोपीद्वारे तपासणी करण्यात आली. n=३. स्केल बार = १०० µm.
नवीन नैसर्गिक उत्पादनांचा शोध आणि वापर यामुळे मानवी जीवनाच्या विविध पैलूंमध्ये, ज्यामध्ये औषध आणि शेतीचा समावेश आहे, लक्षणीय प्रगती झाली आहे. नैसर्गिक संसाधनांमधून उपयुक्त संयुगे मिळविण्यासाठी ऐतिहासिक संशोधन केले गेले आहे. विशेषतः, अ‍ॅक्टिनोमायसीट्स हे नेमाटोड्ससाठी अँटीपॅरासिटिक अँटीबायोटिक्स म्हणून उपयुक्त असल्याचे ओळखले जाते कारण त्यांच्याकडे आयव्हरमेक्टिन आणि ब्लोमायसीनचे शिसे संयुग आणि त्याचे डेरिव्हेटिव्ह्ज असे विविध दुय्यम चयापचय तयार करण्याची क्षमता आहे, जे कर्करोगविरोधी एजंट म्हणून औषधी म्हणून वापरले जातात21,22. त्याचप्रमाणे, अ‍ॅक्टिनोमायसीट्समधून विविध प्रकारचे वनौषधी संयुगे शोधले गेले आहेत, त्यापैकी काही आधीच व्यावसायिकरित्या वापरले जातात1,23. म्हणून, इच्छित जैविक क्रियाकलापांसह नैसर्गिक उत्पादने वेगळे करण्यासाठी अ‍ॅक्टिनोमायसीट मेटाबोलाइट्सचे विश्लेषण एक प्रभावी रणनीती मानली जाते. या अभ्यासात, आम्हाला एस. वेरेन्सिसमधून एक नवीन संयुग, कौमामोनामाइड सापडले आणि ते यशस्वीरित्या संश्लेषित केले गेले. उर्सोनिक ऍसिड हे अर्बेनामाइड आणि त्याच्या डेरिव्हेटिव्ह्जचे कृत्रिम मध्यवर्ती आहे. ते वैशिष्ट्यपूर्ण मुळांना कुरळे करू शकते, मध्यम ते मजबूत वनौषधी क्रियाकलाप प्रदर्शित करू शकते आणि थेट किंवा अप्रत्यक्षपणे वनस्पती सूक्ष्मनलिका खराब करू शकते. तथापि, उर्मोटोनिक आम्लाची कृती करण्याची यंत्रणा विद्यमान मायक्रोट्यूब्यूल इनहिबिटरपेक्षा वेगळी असू शकते, कारण KAND 11 देखील अ‍ॅक्टिन फिलामेंट्समध्ये व्यत्यय आणते आणि पेशी मृत्युस कारणीभूत ठरते, ज्यामुळे उर्मोटोनिक आम्ल आणि त्याचे डेरिव्हेटिव्ह्ज सायटोस्केलेटल संरचनांच्या विस्तृत श्रेणीवर प्रभाव पाडणारी नियामक यंत्रणा सूचित होते.
अर्बेनोनिक आम्लाचे अधिक तपशीलवार वर्णन केल्याने अर्बेनोनिक आम्लाच्या कृतीची यंत्रणा अधिक चांगल्या प्रकारे समजण्यास मदत होईल. विशेषतः, पुढील ध्येय म्हणजे उर्सोनिक आम्लाची कमी झालेल्या सूक्ष्मनलिकांशी बांधण्याची क्षमता मूल्यांकन करणे जेणेकरून उर्सोनिक आम्ल आणि त्याचे डेरिव्हेटिव्ह्ज थेट सूक्ष्मनलिकांवर कार्य करतात आणि त्यांना डिपॉलिमराइज करतात की त्यांच्या कृतीमुळे सूक्ष्मनलिकांचे अस्थिरीकरण होते हे निश्चित होईल. याव्यतिरिक्त, जिथे सूक्ष्मनलिकांचे थेट लक्ष्य नसते, तिथे वनस्पती पेशींवर उर्सोनिक आम्लाचे कृतीचे ठिकाण आणि आण्विक लक्ष्य ओळखल्याने संबंधित संयुगांचे गुणधर्म आणि तंबाखूनाशक क्रियाकलाप सुधारण्याचे संभाव्य मार्ग अधिक समजून घेण्यास मदत होईल. आमच्या जैवक्रियाशीलता चाचणीने अरबीडोप्सिस थालियाना, तंबाखू आणि लिव्हरवॉर्ट सारख्या वनस्पतींच्या वाढीवर उर्सोनिक आम्लाची अद्वितीय सायटोटॉक्सिक क्षमता उघड केली, तर ई. कोलाई किंवा हेला पेशींवर परिणाम झाला नाही. खुल्या कृषी शेतात वापरण्यासाठी तणनाशक म्हणून विकसित केल्यास प्राण्यांच्या पेशींना कमी किंवा कमी विषारीपणा हा उर्सोनिक आम्ल डेरिव्हेटिव्ह्जचा फायदा आहे. खरंच, युकेरियोट्समध्ये सूक्ष्मनलिकांचे सामान्य संरचना असल्याने, वनस्पतींमध्ये त्यांचे निवडक प्रतिबंध हे तणनाशकांसाठी एक प्रमुख आवश्यकता आहे. उदाहरणार्थ, प्रोपिझामाइड, एक मायक्रोट्यूब्यूल डिपॉलिमरायझिंग एजंट जो थेट ट्यूब्युलिनशी बांधला जातो आणि पॉलिमरायझेशनला प्रतिबंधित करतो, तो प्राण्यांच्या पेशींना कमी विषारीपणामुळे तणनाशक म्हणून वापरला जातो24. डिसोपायरामाइडच्या विपरीत, संबंधित बेंझामाइड्समध्ये भिन्न लक्ष्य विशिष्टता असतात. वनस्पती सूक्ष्म नलिकांव्यतिरिक्त, RH-4032 किंवा बेंझोक्सामाइड अनुक्रमे प्राण्यांच्या पेशी किंवा ओमायसीट्सच्या सूक्ष्म नलिकांना देखील प्रतिबंधित करते आणि झालिलामाइड त्याच्या कमी फायटोटॉक्सिसिटीमुळे बुरशीनाशक म्हणून वापरला जातो25,26,27. नवीन शोधलेले अस्वल आणि त्याचे डेरिव्हेटिव्ह्ज वनस्पतींविरुद्ध निवडक सायटोटॉक्सिसिटी प्रदर्शित करतात, परंतु हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की पुढील बदल त्यांच्या लक्ष्य विशिष्टतेत बदल करू शकतात, ज्यामुळे रोगजनक बुरशी किंवा ओमायसीट्सच्या नियंत्रणासाठी अतिरिक्त डेरिव्हेटिव्ह्ज प्रदान होऊ शकतात.
अर्बेनोनिक आम्ल आणि त्याच्या डेरिव्हेटिव्ह्जचे अद्वितीय गुणधर्म तणनाशके म्हणून त्यांच्या विकासासाठी आणि संशोधन साधन म्हणून वापरण्यासाठी उपयुक्त आहेत. वनस्पती पेशींच्या आकार नियंत्रित करण्यासाठी सायटोस्केलेटनचे महत्त्व व्यापकपणे ओळखले जाते. पूर्वीच्या अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की वनस्पतींनी कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल संघटनेची जटिल यंत्रणा विकसित केली आहे ज्यामुळे मॉर्फोजेनेसिस योग्यरित्या नियंत्रित करण्यासाठी मायक्रोट्यूब्यूल गतिशीलता नियंत्रित केली आहे. मायक्रोट्यूब्यूल क्रियाकलापांच्या नियमनासाठी जबाबदार असलेल्या मोठ्या संख्येने रेणू ओळखले गेले आहेत आणि संबंधित संशोधन अजूनही चालू आहे3,4,28. वनस्पती पेशींमधील मायक्रोट्यूब्यूल गतिशीलतेची आमची सध्याची समज कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल संघटनेच्या यंत्रणेचे पूर्णपणे स्पष्टीकरण देत नाही. उदाहरणार्थ, जरी डिसोपायरामाइड आणि ऑरिझालिन दोन्ही मायक्रोट्यूब्यूल डिपॉलिमराइज करू शकतात, तरी डिसोपायरामाइडमुळे मुळांचे गंभीर विकृतीकरण होते तर ऑरिझालिनचा तुलनेने सौम्य परिणाम होतो. शिवाय, मायक्रोट्यूब्यूल स्थिर करणाऱ्या ट्यूब्युलिनमधील उत्परिवर्तनामुळे मुळांमध्ये डेक्स्ट्रोरोटेशन देखील होते, तर पॅक्लिटॅक्सेल, जे मायक्रोट्यूब्यूल गतिशीलता देखील स्थिर करते, तसे करत नाही. म्हणून, उर्सोलिक ऍसिडच्या आण्विक लक्ष्यांचा अभ्यास आणि ओळख केल्याने वनस्पती कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्सच्या नियमनाबद्दल नवीन अंतर्दृष्टी मिळायला हवी. त्याचप्रमाणे, विकृत वाढीस चालना देण्यासाठी प्रभावी असलेल्या रसायनांची, जसे की डिस्ओपायरामाइड, आणि कमी प्रभावी रसायनांची, जसे की ऑरिझालिन किंवा कुमामोटोरिक ऍसिड, भविष्यातील तुलना, विकृत वाढ कशी होते याचे संकेत देईल.
दुसरीकडे, संरक्षणाशी संबंधित सायटोस्केलेटल पुनर्रचना ही उर्सोनिक आम्लाच्या सायटोटॉक्सिसिटीचे स्पष्टीकरण देण्याची आणखी एक शक्यता आहे. रोगजनकाचा संसर्ग किंवा वनस्पती पेशींमध्ये एलिसिटरचा प्रवेश कधीकधी सायटोस्केलेटनचा नाश आणि त्यानंतर पेशी मृत्यूस कारणीभूत ठरतो29. उदाहरणार्थ, ओमायसीट-व्युत्पन्न क्रिप्टोक्सॅन्थिन तंबाखू पेशी मृत्यूपूर्वी सूक्ष्मनलिका आणि अ‍ॅक्टिन तंतूंमध्ये व्यत्यय आणत असल्याचे नोंदवले गेले आहे, जे केएएनडी उपचारांप्रमाणेच होते30,31. उर्सोनिक आम्लामुळे निर्माण होणाऱ्या संरक्षण प्रतिसाद आणि पेशी प्रतिसादांमधील समानतेमुळे आम्हाला असे गृहीत धरले गेले की ते सामान्य पेशी प्रक्रियांना चालना देतात, जरी क्रिप्टोक्सॅन्थिनपेक्षा उर्सोनिक आम्लाचा जलद आणि मजबूत परिणाम स्पष्ट आहे. तथापि, अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की अ‍ॅक्टिन तंतूंमध्ये व्यत्यय आपोआप पेशी मृत्यूला प्रोत्साहन देतो, जो नेहमीच मायक्रोट्यूब्यूल व्यत्ययासह नसतो29. याव्यतिरिक्त, उर्सोनिक आम्लाच्या डेरिव्हेटिव्ह्जप्रमाणे रोगजनक किंवा एलिसिटर मुळांच्या विकृत वाढीस कारणीभूत ठरतात का हे पाहणे बाकी आहे. अशाप्रकारे, संरक्षण प्रतिसाद आणि सायटोस्केलेटन यांना जोडणारे आण्विक ज्ञान ही एक आकर्षक समस्या आहे ज्याकडे लक्ष देणे आवश्यक आहे. उर्सोनिक आम्लाशी संबंधित कमी आण्विक वजनाच्या संयुगांच्या उपस्थितीचा तसेच वेगवेगळ्या क्षमता असलेल्या डेरिव्हेटिव्ह्जचा वापर करून, ते अज्ञात पेशीय यंत्रणांना लक्ष्य करण्याच्या संधी प्रदान करू शकतात.
एकत्रितपणे, सूक्ष्मनलिका गतिमानता नियंत्रित करणाऱ्या नवीन संयुगांचा शोध आणि वापर वनस्पती पेशी आकार निर्धारणाच्या अंतर्गत असलेल्या जटिल आण्विक यंत्रणांना तोंड देण्यासाठी शक्तिशाली पद्धती प्रदान करेल. या संदर्भात, अलिकडेच विकसित झालेले संयुग उर्मोटोनिक आम्ल, जे सूक्ष्मनलिका आणि अ‍ॅक्टिन तंतूंवर परिणाम करते आणि पेशी मृत्युला प्रवृत्त करते, ते सूक्ष्मनलिका नियंत्रण आणि या इतर यंत्रणांमधील संबंध उलगडण्याची संधी प्रदान करू शकते. अशाप्रकारे, अर्बेनोनिक आम्ल वापरून रासायनिक आणि जैविक विश्लेषण आपल्याला वनस्पती सायटोस्केलेटन नियंत्रित करणाऱ्या आण्विक नियामक यंत्रणा समजून घेण्यास मदत करेल.
एस. वेरेन्सिस एमके४९३-सीएफ१ ला ५०० मिली गोंधळलेल्या एर्लेनमेयर फ्लास्कमध्ये टोचून घ्या ज्यामध्ये ११० मिली बियाणे माध्यम आहे ज्यामध्ये २% (w/v) गॅलेक्टोज, २% (w/v) एसेन्स पेस्ट, १% (w/v) बॅक्टो रचना आहे. -सोयटन (थर्मो फिशर सायंटिफिक, इंक.), ०.५% (w/v) कॉर्न अर्क (KOGOSTCH कंपनी लिमिटेड, जपान), ०.२% (w/v) (NH4)2SO4 आणि ०.२% CaCO3 डीआयोनाइज्ड पाण्यात मिसळा. (निर्जंतुकीकरण करण्यापूर्वी pH ७.४). बियाणे कल्चर रोटरी शेकर (१८० आरपीएम) वर २७°C वर २ दिवसांसाठी उबवले गेले. घन अवस्थेतील किण्वन द्वारे उत्पादन लागवड. बियाणे कल्चर (७ मिली) ५०० मिली K-१ फ्लास्कमध्ये हस्तांतरित करण्यात आले ज्यामध्ये ४० ग्रॅम उत्पादन माध्यम होते ज्यामध्ये १५ ग्रॅम दाबलेले बार्ली (MUSO Co., Ltd., जपान) आणि २५ ग्रॅम डीआयोनाइज्ड पाणी (निर्जंतुकीकरणापूर्वी pH समायोजित केले गेले नाही) होते. किण्वन ३०°C वर १४ दिवसांसाठी अंधारात केले गेले. किण्वन सामग्री ४० मिली/बाटली EtOH वापरून काढली गेली आणि सेंट्रीफ्यूज केली गेली (१५०० ग्रॅम, ४°C, १० मिनिटे). कल्चर सुपरनॅटंट (६० मिली) १०% MeOH/EtOAc च्या मिश्रणाने काढली गेली. कमी दाबाने बाष्पीभवन करून सेंद्रिय थराचे अवशेष (५९.५ मिलीग्राम) मिळवण्यात आले, ज्याला रिव्हर्स फेज कॉलमवर ग्रेडियंट एल्युशन (०-१० मिनिटे: ९०%) सह HPLC ला अधीन करण्यात आले (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, ५ μm, ID १० मिमी × लांबी २५० मिमी) H2O/CH3CN, १०-३५ मिनिटे: ९०% H2O/CH3CN ते ७०% H2O/CH3CN (ग्रेडियंट), ३५-४५ मिनिटे: ९०% H2O/EtOH, ४५-१५५ मिनिटे: ९०% H2O/EtOH ते १००% EtOH (ग्रेडियंट (ग्रेडियंट), १५५-२०० मिनिट: १००% EtOH) १.५ मिली/मिनिटाच्या प्रवाह दराने, कौमामोनामाइड (१, ३६.० मिलीग्राम) पांढर्‍या आकारहीन पावडरच्या स्वरूपात वेगळे करण्यात आले.
कुमामोटोअमाइड(१); १H-NMR (५०० MHz, CDCl३) δ ६.९३ (t, J = २.५ Hz, १H), ६.७६ (dd, J = ४.३, १.८ Hz १H), ६.०५ (t, J = ३.८ Hz, १H). ), ४.०८ (s, ३H); १३C-NMR (१२५ MHz, CDCl३) δ १६१.१, १२१.०, ११९.९, ११२.२, १०५.०, ६८.३; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ गणना केलेले मूल्य: १४१.०६५९, मोजलेले मूल्य: १४१.०६६३, IR ν कमाल ३४५१, ३४१४, ३१७३, २९३८, १६०३, १५९३, १५३७ सेमी–१.
कोलंबिया बियाणे (Col-0) संशोधन वापरासाठी परवानगी घेऊन अरबीडोप्सिस बायोलॉजिकल रिसोर्स सेंटर (ABRC) कडून मिळवण्यात आले. आमच्या प्रयोगशाळेच्या परिस्थितीत कॉलीडोप्सिस बियाणे प्रसारित आणि देखभाल करण्यात आले आणि जंगली प्रकारच्या अरबीडोप्सिस वनस्पती म्हणून वापरले गेले. अरबीडोप्सिस बियाणे पृष्ठभागावर निर्जंतुकीकरण केले गेले आणि अर्ध-शक्ती असलेल्या मुराशिगे आणि स्कूग माध्यमात संवर्धन केले गेले ज्यामध्ये 2% सुक्रोज (फुजीफिल्म वाको प्युअर केमिकल), 0.05% (w/v) 2-(4-मॉर्फोलिनो) इथेनसल्फोनिक अॅसिड (MES) (फुजीफिल्म वाको प्युअर केमिकल) आणि 1.5% अगर (फुजीफिल्म वाको प्युअर केमिकल), pH 5.7, 23 °C आणि सतत प्रकाशात होते. phs1-1 उत्परिवर्तनाचे बियाणे टी. हाशिमोटो (नारा इन्स्टिट्यूट ऑफ सायन्स अँड टेक्नॉलॉजी) द्वारे प्रदान केले गेले.
SR-1 या जातीच्या बिया टी. हाशिमोटो (नारा इन्स्टिट्यूट ऑफ सायन्स अँड टेक्नॉलॉजी) द्वारे पुरवल्या गेल्या आणि त्यांचा वापर जंगली प्रकारच्या तंबाखू वनस्पती म्हणून केला गेला. उगवण वाढविण्यासाठी तंबाखूच्या बिया पृष्ठभागावर निर्जंतुक केल्या गेल्या आणि निर्जंतुक पाण्यात तीन रात्री भिजवल्या गेल्या, नंतर २% सुक्रोज, ०.०५% (w/v) MES आणि ०.८% जेलन गम (फुजीफिल्म वाको प्युअर केमिकल) मुराशिगे आणि स्कूग माध्यम) असलेल्या अर्ध्या-शक्तीच्या द्रावणात pH ५.७ सह ठेवले गेले आणि सतत प्रकाशात २३°C वर उबवले गेले.
स्ट्रेन टाक-१ हे टी. कोहची (क्योटो विद्यापीठ) यांनी प्रदान केले होते आणि लिव्हरवॉर्ट अभ्यासासाठी मानक प्रायोगिक युनिट म्हणून वापरले गेले होते. जेम्मा निर्जंतुकीकरण केलेल्या संवर्धित वनस्पतींपासून मिळवले गेले आणि नंतर १% सुक्रोज आणि ०.३% जेलन गम असलेल्या गॅम्बोर्ग बी५ माध्यमावर (फुजीफिल्म वाको प्युअर केमिकल) प्लेट केले गेले आणि सतत प्रकाशात २३°C वर उबवले गेले.
तंबाखू BY-2 पेशी (निकोटियाना टॅबॅकम एल. सीव्ही. ब्राइट यलो २) एस. हसेझावा (टोकियो विद्यापीठ) यांनी प्रदान केल्या. BY-2 पेशी सुधारित लिन्समीयर आणि स्कूग माध्यमात ९५ पट पातळ केल्या गेल्या आणि आठवड्यातून २,४-डायक्लोरोफेनोक्सायसेटिक अॅसिड ३२ ने पूरक केल्या गेल्या. सेल सस्पेंशन रोटरी शेकरवर १३० आरपीएमवर २७°C वर अंधारात मिसळले गेले. ताज्या माध्यमाच्या १० पट आकारमानाने पेशी धुवा आणि त्याच माध्यमात पुन्हा सस्पेंड करा. फुलकोबी मोज़ेक विषाणू ३५S प्रमोटर अंतर्गत मायक्रोट्यूब्यूल मार्कर TagRFP-TUA6 किंवा अ‍ॅक्टिन फिलामेंट मार्कर GFP-ABD2 स्थिरपणे व्यक्त करणाऱ्या BY-2 ट्रान्सजेनिक सेल लाईन्स वर्णन केल्याप्रमाणे तयार केल्या गेल्या ३३,३४,३५. मूळ BY-2 सेल लाईनसाठी वापरल्या जाणाऱ्या प्रक्रिया वापरून या सेल लाईन्स राखल्या आणि समक्रमित केल्या जाऊ शकतात.
हेला पेशींचे संवर्धन डल्बेकोच्या सुधारित ईगलच्या माध्यमात (DMEM) (लाइफ टेक्नॉलॉजीज) केले गेले, ज्यामध्ये १०% फेटल बोवाइन सीरम, १.२ U/ml पेनिसिलिन आणि १.२ μg/ml स्ट्रेप्टोमायसिनचा समावेश होता, ज्याचे पूरक ५% CO2 असलेल्या ३७°C तापमानाच्या इनक्यूबेटरमध्ये होते.
या हस्तलिखितात वर्णन केलेले सर्व प्रयोग जपानी जैवसुरक्षा नियम आणि मार्गदर्शक तत्त्वांनुसार केले गेले.
संयुगे डायमिथाइल सल्फोक्साइड (DMSO; फुजीफिल्म वाको प्युअर केमिकल) मध्ये स्टॉक सोल्युशन म्हणून विरघळवली गेली आणि अरबीडोप्सिस आणि तंबाखूसाठी MS माध्यमात किंवा लिव्हरवॉर्टसाठी गॅम्बोर्ग B5 माध्यमात पातळ केली गेली. मुळांच्या वाढीच्या प्रतिबंधक चाचण्यांसाठी, सूचित संयुगे किंवा DMSO असलेल्या आगर माध्यमावर प्रति प्लेट १० पेक्षा जास्त बियाणे पेरण्यात आले. बियाणे ७ दिवसांसाठी वाढीच्या कक्षात उबवण्यात आले. रोपांचे छायाचित्र काढण्यात आले आणि मुळांची लांबी मोजण्यात आली. अरबीडोप्सिस उगवण चाचणीसाठी, २०० μM संयुगे किंवा DMSO असलेल्या आगर माध्यमावर प्रति प्लेट ४८ बियाणे पेरण्यात आले. अरबीडोप्सिस बियाणे वाढीच्या कक्षात वाढवण्यात आले आणि अंकुरित रोपांची संख्या उगवणानंतर ७ दिवसांनी मोजण्यात आली (दिवस). तंबाखूच्या अंकुरित चाचणीसाठी, २०० μM KAND किंवा DMSO असलेल्या आगर माध्यमावर प्रति प्लेट २४ बियाणे पेरण्यात आले. तंबाखूच्या बिया वाढीच्या कक्षात वाढवण्यात आल्या आणि अंकुरित रोपांची संख्या १४ दिवसांनी मोजण्यात आली. लिव्हरवॉर्ट ग्रोथ इन्हिबिशन अॅसेसाठी, प्रत्येक प्लेटमधील 9 भ्रूणांना KAND किंवा DMSO चे सूचित सांद्रता असलेल्या अगर माध्यमावर प्लेट केले गेले आणि 14 दिवसांसाठी ग्रोथ चेंबरमध्ये ठेवले गेले.
रूट मेरिस्टेम संघटनेची कल्पना करण्यासाठी 5 मिलीग्राम/मिली प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) ने रंगवलेल्या रोपांचा वापर करा. TCS SPE कॉन्फोकल लेसर स्कॅनिंग मायक्रोस्कोप (Leica Microsystems) वापरून फ्लोरोसेन्स मायक्रोस्कोपीद्वारे PI सिग्नल पाहिले गेले.
मलामी आणि बेन्फेय यांनी वर्णन केलेल्या प्रोटोकॉलनुसार β-ग्लुकुरोनिडेस (GUS) सह मुळांचे हिस्टोकेमिकल स्टेनिंग करण्यात आले. रोपे रात्रभर 90% एसीटोनमध्ये निश्चित केली गेली, GUS बफरमध्ये 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid ने 1 तासासाठी रंगवली गेली आणि हायड्रेटेड क्लोराल्डिहाइड द्रावणात ठेवली गेली. (8 ग्रॅम क्लोराल हायड्रेट, 2 मिली पाणी आणि 1 मिली ग्लिसरॉल) आणि अ‍ॅक्सिओ इमेजर M1 मायक्रोस्कोप (कार्ल झीस) वापरून डिफरेंशियल इंटरफेरन्स कॉन्ट्रास्ट मायक्रोस्कोपीद्वारे निरीक्षण केले गेले.
उभ्या ठेवलेल्या प्लेट्सवर वाढवलेल्या ७ दिवसांच्या रोपांवर मुळांचा कोन मोजण्यात आला. चरण ६ मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे गुरुत्वाकर्षण सदिशाच्या दिशेपासून मुळाचा कोन मोजा.
प्रोटोकॉल 37 मध्ये किरकोळ बदल करून, कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्सची व्यवस्था वर्णन केल्याप्रमाणे पाहिली गेली. अँटी-β-ट्यूब्युलिन अँटीबॉडी (KMX-1, मर्क मिलिपोर: MAB3408) आणि अलेक्सा फ्लोर 488-कंज्युगेटेड अँटी-माऊस IgG (थर्मो फिशर सायंटिफिक: A32723) अनुक्रमे 1:1000 आणि 1:100 डायल्युशनवर प्राथमिक आणि दुय्यम अँटीबॉडी म्हणून वापरली गेली. TCS SPE कॉन्फोकल लेसर स्कॅनिंग मायक्रोस्कोप (Leica Microsystems) वापरून फ्लोरोसेन्स प्रतिमा मिळवल्या गेल्या. Z-स्टॅक प्रतिमा मिळवा आणि उत्पादकाच्या सूचनांनुसार जास्तीत जास्त तीव्रतेचे अंदाज तयार करा.
उत्पादकाच्या सूचनांनुसार सेल काउंटिंग किट 8 (डोजिंडो) वापरून HeLa पेशी प्रसार चाचणी करण्यात आली.
६०० एनएम (OD600) वर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर वापरून कल्चरमध्ये पेशींची घनता मोजून ई. कोलाई DH5α च्या वाढीचे विश्लेषण केले गेले.
CSU-X1 कॉन्फोकल स्कॅनिंग डिव्हाइस (योकोगावा) आणि sCMOS कॅमेरा (झायला, अँडोर टेक्नॉलॉजी) ने सुसज्ज असलेल्या फ्लोरोसेन्स मायक्रोस्कोपचा वापर करून ट्रान्सजेनिक BY-2 पेशींमधील सायटोस्केलेटल संघटना पाहिली गेली. सायटोस्केलेटल घनतेचे मूल्यांकन प्रतिमा विश्लेषणाद्वारे केले गेले, ज्याने वर्णन केल्याप्रमाणे इमेजजे सॉफ्टवेअर वापरून कॉन्फोकल प्रतिमांमधील सायटोप्लाज्मिक पिक्सेलमध्ये सायटोस्केलेटल पिक्सेलची टक्केवारी मोजली.
BY-2 पेशींमध्ये पेशी मृत्यु शोधण्यासाठी, सेल सस्पेंशनचा एक भाग खोलीच्या तपमानावर 0.05% इव्हान्स ब्लूसह 10 मिनिटांसाठी इनक्युबेट करण्यात आला. मृत पेशींचे निवडक इव्हान्स ब्लू डाग अखंड प्लाझ्मा झिल्लीद्वारे व्यवहार्य पेशींमधून रंग बाहेर काढण्यावर अवलंबून असते40. रंगीत पेशींचे निरीक्षण ब्राइट-फील्ड मायक्रोस्कोप (BX53, ऑलिंपस) वापरून करण्यात आले.
३७°C तापमानावर आर्द्रता असलेल्या इनक्यूबेटरमध्ये १०% FBS आणि ५% CO2 सह DMEM मध्ये HeLa पेशींची वाढ करण्यात आली. पेशींवर १०० μM KAND ११, कुमामोनामिक अॅसिड ६, कुमामोनामाइड १, १०० ng/ml कोल्सेमिड (गिबको) किंवा १०० ng/ml नोकोडमेझ (सिग्मा) वापरून ६ तासांसाठी ३७°C तापमानावर उपचार करण्यात आले. पेशींना १० मिनिटांसाठी MetOH आणि नंतर खोलीच्या तपमानावर ५ मिनिटांसाठी एसीटेटने फिक्स करण्यात आले. स्थिर पेशींना β-ट्यूब्युलिन प्राथमिक अँटीबॉडी (१D४A४, प्रोटीनटेक: ६६२४०-१) ने ०.५% BSA/PBS मध्ये पातळ करून २ तासांसाठी इनक्युबेट करण्यात आले, TBST ने ३ वेळा धुतले गेले आणि नंतर अलेक्सा फ्लोर गोट अँटीबॉडीने इनक्युबेट करण्यात आले. ४८८ १ तास. – माऊस आयजीजी (थर्मो फिशर सायंटिफिक: ए११००१) आणि १५ एनजी/मिली ४′,६-डायमिडिनो-२-फेनिलिंडोल (डीएपीआय) ०.५% बीएसए/पीबीएसमध्ये पातळ केले. तीन वेळा टीबीएसटीने धुतल्यानंतर, निकॉन एक्लिप्स टीआय-ई इन्व्हर्टेड मायक्रोस्कोपवर डाग असलेल्या पेशींचे निरीक्षण केले गेले. मेटामॉर्फ सॉफ्टवेअर (मॉलिक्युलर डिव्हाइसेस) वापरून थंड केलेल्या हमामात्सु ओआरसीए-आर२ सीसीडी कॅमेऱ्याने प्रतिमा कॅप्चर करण्यात आल्या.
पोस्ट वेळ: जून-१७-२०२४