Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद.तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझरच्या आवृत्तीमध्ये मर्यादित CSS सपोर्ट आहे.सर्वोत्तम परिणामांसाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही तुमच्या ब्राउझरची नवीन आवृत्ती वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये सुसंगतता मोड अक्षम करा).दरम्यान, चालू असलेल्या समर्थनाची खात्री करण्यासाठी, आम्ही स्टाईल किंवा JavaScript शिवाय साइट दाखवत आहोत.
नैसर्गिक उत्पादनांचा शोध आणि फायदेशीर वापर मानवी जीवन सुधारण्यास मदत करू शकतो.तणांच्या नियंत्रणासाठी वनस्पतींच्या वाढीस प्रतिबंधक रसायने तणनाशक म्हणून मोठ्या प्रमाणावर वापरली जातात.विविध प्रकारच्या तणनाशकांचा वापर करण्याच्या गरजेमुळे, कृतीच्या नवीन यंत्रणेसह संयुगे ओळखण्याची गरज आहे.या अभ्यासात, आम्ही Streptomyces werraensis MK493-CF1 मधील N -alkoxypyrrole कंपाऊंड, coumamonamide शोधले आणि संपूर्ण संश्लेषण प्रक्रिया स्थापित केली.जैविक क्रियाकलापांच्या अभ्यासाद्वारे, आम्हाला आढळून आले की urs-monoamic acid हे urs-monoamide चे सिंथेटिक इंटरमीडिएट आहे आणि संभाव्यवनस्पती वाढ अवरोधक.याव्यतिरिक्त, आम्ही विविध अर्बेनोनिक ऍसिड डेरिव्हेटिव्ह विकसित केले आहेत, ज्यात अर्बेनिलॉक्सी डेरिव्हेटिव्ह (UDA) समाविष्ट आहे, ज्यामध्ये HeLa पेशींच्या वाढीवर नकारात्मक परिणाम न करता उच्च तणनाशक क्रियाकलाप आहेत.आम्हाला असेही आढळले की urmotonic acid डेरिव्हेटिव्ह्ज वनस्पती सूक्ष्मनलिका व्यत्यय आणतात;याव्यतिरिक्त, KAND ऍक्टिन फिलामेंट्सवर परिणाम करते आणि सेल मृत्यूला प्रवृत्त करते;हे बहुआयामी परिणाम ज्ञात मायक्रोट्यूब्यूल इनहिबिटरपेक्षा वेगळे आहेत आणि ursonic ऍसिडसाठी कृतीची एक नवीन यंत्रणा सुचवतात, जी नवीन तणनाशकांच्या विकासामध्ये एक महत्त्वाचा फायदा दर्शवते.
फायदेशीर नैसर्गिक उत्पादने आणि त्यांच्या डेरिव्हेटिव्ह्जचा शोध आणि व्यावहारिक उपयोग मानवी जीवनाची गुणवत्ता सुधारण्याचे एक साधन आहे.सूक्ष्मजीव, वनस्पती आणि कीटकांद्वारे निर्मित दुय्यम चयापचयांमुळे औषध आणि शेतीमध्ये मोठी प्रगती झाली आहे.नैसर्गिक उत्पादनांपासून अनेक प्रतिजैविक आणि ल्युकेमियाविरोधी औषधे विकसित केली गेली आहेत.याव्यतिरिक्त, विविध प्रकारचेकीटकनाशके, बुरशीनाशके आणि तणनाशके या नैसर्गिक उत्पादनांमधून शेतीमध्ये वापरण्यासाठी काढली जातात.विशेषतः, तण नियंत्रण तणनाशके ही आधुनिक शेतीमध्ये पीक उत्पादन वाढवण्यासाठी महत्त्वाची साधने आहेत आणि विविध प्रकारची संयुगे आधीच व्यावसायिकरित्या वापरली जात आहेत.प्रकाशसंश्लेषण, एमिनो आम्ल चयापचय, सेल भिंत संश्लेषण, माइटोसिसचे नियमन, फायटोहार्मोन सिग्नलिंग किंवा प्रथिने संश्लेषण यासारख्या वनस्पतींमधील अनेक सेल्युलर प्रक्रिया तणनाशकांचे वैशिष्ट्यपूर्ण लक्ष्य मानले जातात.मायक्रोट्यूब्यूल फंक्शनला प्रतिबंध करणारी संयुगे ही तणनाशकांचा एक सामान्य वर्ग आहे जो माइटोटिक नियमन2 वर परिणाम करून वनस्पतींच्या वाढीवर परिणाम करतो.
मायक्रोट्यूब्यूल्स हे सायटोस्केलेटनचे घटक आहेत आणि युकेरियोटिक पेशींमध्ये मोठ्या प्रमाणावर संरक्षित आहेत.ट्यूबिलिन हेटरोडाइमरमध्ये α-ट्यूब्युलिन आणि β-ट्यूब्युलिन बनवणारे रेषीय मायक्रोट्यूब्यूल प्रोटोफिलामेंट्स असतात, ज्यामध्ये 13 प्रोटोफिलामेंट एक दंडगोलाकार रचना बनवतात.सूक्ष्मनलिका वनस्पती पेशींमध्ये अनेक भूमिका निभावतात, ज्यामध्ये पेशींचा आकार, पेशी विभाजन आणि अंतःकोशिकीय वाहतूक 3,4 यांचा समावेश होतो.वनस्पती पेशींमध्ये इंटरफेस प्लाझ्मा झिल्लीच्या खाली मायक्रोट्यूब्यूल असतात आणि या तथाकथित कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्स सेल्युलोज सिंथेस कॉम्प्लेक्स 4,5 च्या नियमनद्वारे सेल्युलोज मायक्रोफायब्रिल्सच्या संघटनेवर नियंत्रण ठेवतात असे मानले जाते.मूळ एपिडर्मल पेशींचे कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल, रूटच्या टोकाच्या वेगवान वाढीच्या झोनमध्ये असतात, पार्श्वभागी असतात आणि सेल्युलोज मायक्रोफायबर या सूक्ष्मनलिकांचे अनुसरण करतात आणि सेल विस्ताराची दिशा मर्यादित करतात, ज्यामुळे ॲनिसोट्रॉपिक पेशी वाढण्यास प्रोत्साहन मिळते.म्हणून, मायक्रोट्यूब्यूलचे कार्य वनस्पती आकारविज्ञानाशी जवळून संबंधित आहे.जीन्स एन्कोडिंग ट्युब्युलिनमधील एमिनो ॲसिड प्रतिस्थापनांमुळे कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल ॲरे आणि अरबीडोप्सिस 6,7 मध्ये डाव्या-किंवा उजव्या बाजूची वाढ होते.त्याचप्रमाणे, मायक्रोट्यूब्यूल-संबंधित प्रथिनांमधील उत्परिवर्तन जे मायक्रोट्यूब्यूल डायनॅमिक्सचे नियमन करतात ते देखील विकृत रूट वाढीस कारणीभूत ठरू शकतात8,9,10,11,12,13.याव्यतिरिक्त, डिसोपायरामाइड सारख्या मायक्रोट्यूब्यूल-व्यत्यय आणणाऱ्या तणनाशकांसह उपचार, ज्याला प्रीटीलाक्लोर देखील म्हणतात, देखील डाव्या बाजूच्या तिरकस मुळांच्या वाढीस कारणीभूत ठरते.हे डेटा सूचित करतात की वनस्पतींच्या वाढीची दिशा ठरवण्यासाठी मायक्रोट्यूब्यूल फंक्शनचे अचूक नियमन महत्त्वपूर्ण आहे.
मायक्रोट्यूब्यूल इनहिबिटरचे विविध प्रकार शोधले गेले आहेत आणि या औषधांनी सायटोस्केलेटल संशोधन तसेच शेती आणि औषधी 2 मध्ये महत्त्वपूर्ण योगदान दिले आहे.विशेषतः, oryzalin, dinitroaniline संयुगे, disopyramide, benzamide-संबंधित संयुगे आणि त्यांचे analogs मायक्रोट्यूब्यूलचे कार्य रोखू शकतात आणि त्यामुळे वनस्पतींच्या वाढीस प्रतिबंध करतात.म्हणून, ते तणनाशक म्हणून मोठ्या प्रमाणावर वापरले जातात.तथापि, मायक्रोट्यूब्यूल हे वनस्पती आणि प्राणी पेशींचे एक महत्त्वाचे घटक असल्याने, बहुतेक मायक्रोट्यूब्यूल इनहिबिटर दोन्ही प्रकारच्या पेशींसाठी सायटोटॉक्सिक असतात.म्हणून, तणनाशक म्हणून त्यांची उपयुक्तता ओळखली जात असूनही, मर्यादित संख्येत अँटीमायक्रोट्यूब्यूल एजंट्स व्यावहारिक हेतूंसाठी वापरली जातात.
स्ट्रेप्टोमायसेस हे स्ट्रेप्टोमायसिस कुटुंबातील एक वंश आहे, ज्यामध्ये एरोबिक, ग्राम-पॉझिटिव्ह, फिलामेंटस बॅक्टेरियाचा समावेश आहे आणि ते दुय्यम चयापचयांच्या विस्तृत श्रेणी तयार करण्याच्या क्षमतेसाठी व्यापकपणे ओळखले जाते.म्हणून, हे नवीन जैविक दृष्ट्या सक्रिय नैसर्गिक उत्पादनांचे सर्वात महत्वाचे स्त्रोत मानले जाते.सध्याच्या अभ्यासात, आम्हाला कूमामोनामाइड नावाचे एक नवीन संयुग सापडले, जे स्ट्रेप्टोमायसेस व्हेररेन्सिस MK493-CF1 आणि S. werraensis ISP 5486 पासून वेगळे होते. स्पेक्ट्रल विश्लेषण आणि पूर्ण वर्णक्रमीय विश्लेषण वापरून, कूमामोनामाइडची रचना वैशिष्ट्यीकृत केली गेली आणि त्याचे अनोखे एन-एक्रॉइड्स एन-सीएफ 1. निश्चित केले होते.संश्लेषण.Ursmonic acid, ursmonoamide आणि त्याचे डेरिव्हेटिव्ह्जचे एक कृत्रिम मध्यवर्ती, Arabidopsis thaliana या लोकप्रिय मॉडेल वनस्पतीची वाढ आणि उगवण प्रतिबंधित करते.संरचना-क्रियाकलाप संबंध अभ्यासामध्ये, आम्हाला आढळले की C9 सह युरसोनिक ऍसिडमध्ये बदललेले संयुग, ज्याला नॉनिलॉक्सी डेरिव्हेटिव्ह ऑफ ursonic ऍसिड (KAND) म्हणतात, वाढ आणि उगवण वर प्रतिबंधात्मक प्रभाव लक्षणीयरीत्या वाढवते.विशेष म्हणजे, नव्याने सापडलेल्या वनस्पतींच्या वाढीचा प्रतिबंधक देखील तंबाखू आणि लिव्हरवॉर्टच्या वाढीवर परिणाम करतो आणि ते जीवाणू किंवा HeLa पेशींना सायटोटॉक्सिक नव्हते.शिवाय, काही urmotonic acid डेरिव्हेटिव्ह्ज विकृत रूट फेनोटाइप निर्माण करतात, याचा अर्थ असा होतो की हे डेरिव्हेटिव्ह थेट किंवा अप्रत्यक्षपणे सूक्ष्मनलिका प्रभावित करतात.या कल्पनेशी सुसंगत, इम्युनोहिस्टोकेमिकली किंवा फ्लोरोसेंट प्रथिने लेबल केलेल्या मायक्रोट्यूब्यूल्सची आमची निरीक्षणे सूचित करतात की KAND उपचार मायक्रोट्यूब्यूल्स डिपॉलिमराइज करतात.याव्यतिरिक्त, कुमामोटोनिक ऍसिड डेरिव्हेटिव्हसह उपचाराने ऍक्टिन मायक्रोफिलामेंट्समध्ये व्यत्यय आणला.अशा प्रकारे, आम्ही एक नवीन वनस्पती वाढ अवरोधक शोधून काढले आहे ज्याच्या क्रियेच्या अद्वितीय पद्धतीमध्ये सायटोस्केलेटनचा नाश होतो.
MK493-CF1 हा ताण शिनागावा-कु, टोकियो येथे मातीपासून वेगळा करण्यात आला.MK493-CF1 स्ट्रेन चांगली-शाखित स्ट्रोमल मायसेलियम तयार करतो.16S ribosomal RNA जनुकाचा आंशिक क्रम (1422 bp) निर्धारित करण्यात आला.हा स्ट्रेन S. werraensis सारखाच आहे (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: ठराविक स्ट्रेन, 99.93%).या निकालाच्या आधारे, हे निर्धारित केले गेले की हा ताण S. werraensis च्या प्रकाराशी जवळून संबंधित आहे.म्हणून, आम्ही या स्ट्रेनला S. werraensis MK493-CF1 असे तात्पुरते नाव दिले.S. werraensis ISP 5486T देखील समान बायोएक्टिव्ह संयुगे तयार करते.या सूक्ष्मजीवापासून नैसर्गिक उत्पादने मिळवण्याबाबत फार कमी संशोधन झाले असल्याने, पुढील रासायनिक संशोधन करण्यात आले.S. werraensis MK493-CF1 ची बार्ली माध्यमावर सॉलिड-स्टेट किण्वन करून 30°C तापमानावर 14 दिवसांसाठी लागवड केल्यानंतर, 50% EtOH सह माध्यम काढले गेले.59.5 मिलीग्राम क्रूड अर्क मिळविण्यासाठी 60 मिली नमुना वाळवला गेला.कच्च्या अर्काला N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, coumamonamide, 36.0 mg नावाचे) देण्यासाठी रिव्हर्स फेज HPLC च्या अधीन होते.1 ची एकूण रक्कम क्रूड अर्काच्या अंदाजे 60% आहे.म्हणून, आम्ही कुमामोटोमाइड 1 च्या गुणधर्मांचा तपशीलवार अभ्यास करण्याचा निर्णय घेतला.
Coumamonamide 1 एक पांढरा आकारहीन पावडर आहे आणि उच्च रिझोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HRESIMS) C6H8N2O2 (चित्र 1) पुष्टी करते.या कंपाऊंडचा C2-पर्यायी पायरोल तुकडा δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR स्पेक्ट्रम: 4.5 Hz द्वारे वैशिष्ट्यीकृत आहे. , H-5) आणि δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), आणि 13C NMR स्पेक्ट्रम चार sp2 कार्बन अणूंची उपस्थिती दर्शविते.δC 161.1 वर C-3 प्रोटॉन ते अमाइड कार्बोनिल कार्बनशी HMBC सहसंबंधाद्वारे C2 स्थानावर अमाइड गटाच्या उपस्थितीचे मूल्यांकन केले गेले.याव्यतिरिक्त, δH 4.10 (3H, S) आणि δC 68.3 वर 1 H आणि 13 C NMR शिखर रेणूमध्ये N-methoxy गटांची उपस्थिती दर्शवते.वर्धित फरक स्पेक्ट्रोस्कोपी आणि न्यूक्लियर ओव्हरहाउसर संक्षेप (NOEDF) सारख्या स्पेक्ट्रोस्कोपिक विश्लेषणाचा वापर करून मेथॉक्सी गटाची योग्य स्थिती अद्याप निश्चित केली गेली नसली तरी, N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide हे पहिले उमेदवार कंपाऊंड बनले.
1 ची योग्य रचना निश्चित करण्यासाठी, एकूण संश्लेषण केले गेले (Fig. 2a).एम-सीपीबीए सह व्यावसायिकरित्या उपलब्ध 2-अमीनोपायरीडाइन 2 च्या उपचारांमुळे परिमाणवाचक उत्पन्नात संबंधित एन-ऑक्साइड 3 प्राप्त झाले.2 च्या 2-अमीनोअझिडेशन नंतर, अब्रामोविचने वर्णन केलेली सायक्लोकॉन्डेन्सेशन प्रतिक्रिया बेंझिनमध्ये 90 डिग्री सेल्सिअस तापमानात इच्छित 1-हायड्रॉक्सी-1एच-पायरोल-2-कार्बोनिट्रिल 5 ग्रॅममध्ये प्राप्त करण्यासाठी केली गेली.गती 60% (दोन टप्पे).१५,१६.4 च्या मेथिलेशन आणि हायड्रोलिसिसने नंतर 1-मेथॉक्सी-1एच-पायरोल-2-कार्बोक्झिलिक ऍसिड ("क्युमोटोनिक ऍसिड", 6) चांगले उत्पन्न (70%, दोन चरण) दिले.शेवटी, ऍसिड क्लोराईड इंटरमीडिएट 6 द्वारे जलीय अमोनियाचा वापर करून कुमामोटो अमाइड 1 मधील 98% उत्पन्न मिळाले.संश्लेषित 1 चा सर्व वर्णक्रमीय डेटा पृथक 1 सारखाच होता, म्हणून 1 ची रचना निश्चित केली गेली;
सामान्य संश्लेषण आणि urbenamide आणि urbenic ऍसिड च्या जैविक क्रियाकलाप विश्लेषण.(a) कुमामोटो अमाइडचे एकूण संश्लेषण.(b) सात दिवसांची जंगली प्रकारची अरेबिडोप्सिस कोलंबिया (कोल) रोपे मुराशिगे आणि स्कूग (एमएस) प्लेट्सवर कूमामोनामाइड 6 किंवा कूमामोनामाइड 1 दर्शविलेल्या एकाग्रतेवर उगवली गेली.स्केल बार = 1 सेमी.
प्रथम, आम्ही अर्बेनामाइडच्या जैविक क्रियाकलापांचे मूल्यमापन केले आणि त्याच्या मध्यवर्ती वनस्पतींच्या वाढीमध्ये सुधारणा करण्याच्या क्षमतेसाठी.आम्ही MS agar मध्यम आणि संवर्धित अरबीडोप्सिस थालियाना रोपे या माध्यमात उर्स्मोनामाइड 1 किंवा ursmonic ऍसिड 6 ची विविध सांद्रता जोडली.या परीक्षणांनी दर्शविले की 6 मधील उच्च सांद्रता (500 μM) मुळांच्या वाढीस प्रतिबंधित करते (Fig. 2b).पुढे, आम्ही 6 ची N1 स्थिती बदलून विविध डेरिव्हेटिव्ह्ज व्युत्पन्न केले आणि त्यांच्यावर रचना-क्रियाकलाप संबंध अभ्यास केला (एनालॉग संश्लेषण प्रक्रियेचे वर्णन सहाय्यक माहिती (SI) मध्ये केले आहे).अरबीडोप्सिसची रोपे 50 μM ursonic acid डेरिव्हेटिव्ह असलेल्या माध्यमावर उगवली गेली आणि मुळांची लांबी मोजली गेली.चित्रात दाखवल्याप्रमाणे.आकृती 3a, b, आणि S1 मध्ये दर्शविल्याप्रमाणे, कूमामो ऍसिडमध्ये N1 स्थानावर रेखीय अल्कोक्सी चेन (9, 10, 11, 12, आणि 13) किंवा मोठ्या अल्कोक्सी चेन (15, 16, आणि 17) वेगवेगळ्या लांबीच्या असतात.डेरिव्हेटिव्ह्जने मुळांच्या वाढीस महत्त्वपूर्ण प्रतिबंध दर्शविला.याव्यतिरिक्त, आम्हाला आढळले की 200 μM 10, 11, किंवा 17 प्रतिबंधित उगवण (Figs. 3c आणि S2).
कुमामोटो अमाइड आणि संबंधित संयुगे यांच्या रचना-क्रियाकलाप संबंधांचा अभ्यास.(a) analogues ची रचना आणि संश्लेषण योजना.(b) 50 μM क्युमामोनामाइड डेरिव्हेटिव्हसह किंवा त्याशिवाय एमएस माध्यमावर उगवलेल्या 7-दिवस जुन्या रोपांच्या मुळांच्या लांबीचे प्रमाण.तारांकन हे शेम उपचारांमध्ये लक्षणीय फरक दर्शवितात (टी चाचणी, पी< ०.०५).n>18. डेटा सरासरी ± SD म्हणून दर्शविला आहे.nt म्हणजे “चाचणी केली नाही” कारण 50% पेक्षा जास्त बिया अंकुरित झाल्या नाहीत.(c) 200 μM क्युमामोनामाइड आणि संबंधित संयुगे किंवा त्याशिवाय एमएस माध्यमात 7 दिवस उगवलेल्या उपचारित बियांच्या उगवण दराचे प्रमाण.तारांकन शॅम उपचार (ची-स्क्वेअर चाचणी) सह लक्षणीय फरक दर्शवतात.n=96.
विशेष म्हणजे, C9 पेक्षा लांब अल्काइल साइड चेन जोडल्याने प्रतिबंधात्मक क्रियाकलाप कमी झाला, असे सूचित करते की कुमामोटोइक ऍसिड-संबंधित संयुगे त्यांच्या जैविक क्रियाकलापांचे प्रदर्शन करण्यासाठी विशिष्ट आकाराच्या साइड चेनची आवश्यकता असते.
कारण संरचना-क्रियाकलाप संबंध विश्लेषणात असे दिसून आले आहे की C9 चे ursonic acid मध्ये बदल करण्यात आले होते आणि ursonic acid चे nonyloxy व्युत्पन्न (यापुढे KAND 11 म्हणून संदर्भित) हे सर्वात प्रभावी वनस्पती वाढ अवरोधक होते, आम्ही KAND 11 चे अधिक तपशीलवार वर्णन केले. अरेबिडोप्सिसचे उपचार 50 μM KAND 11 ने उगवण जवळजवळ पूर्णपणे रोखले, तर KAND 11 ची कमी सांद्रता (40, 30, 20, किंवा 10 μM) डोस-अवलंबित पद्धतीने मुळांच्या वाढीस प्रतिबंध करते (चित्र 4a, b).KAND 11 रूट मेरिस्टेम व्यवहार्यतेवर परिणाम करते की नाही हे तपासण्यासाठी, आम्ही प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) सह डागलेल्या रूट मेरिस्टेम्सचे परीक्षण केले आणि मेरिस्टेम क्षेत्राचा आकार मोजला.25 μM KAND-11 असलेल्या माध्यमावर उगवलेल्या रोपांच्या मेरिस्टेमचा आकार 151.1 ± 32.5 μm होता, तर DMSO असलेल्या नियंत्रण माध्यमावर उगवलेल्या रोपांच्या मेरिस्टेमचा आकार 264.7 ± 30.8 μm (Figdm,Figdm) होता. , जे सूचित करते की KAND-11 सेल्युलर क्रियाकलाप पुनर्संचयित करते.प्रसार.रूट मेरिस्टेम.याच्याशी सुसंगत, KAND 11 उपचाराने मूळ मेरिस्टेम (चित्र 4e) 17 मधील सेल डिव्हिजन मार्कर CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS सिग्नलचे प्रमाण कमी केले.हे परिणाम सूचित करतात की KAND 11 पेशींच्या प्रसाराची क्रिया कमी करून मुळांच्या वाढीस प्रतिबंध करते.
वाढीवर urbenonic ऍसिड डेरिव्हेटिव्ह्ज (urbenyloxy डेरिव्हेटिव्ह) च्या प्रतिबंधात्मक प्रभावाचे विश्लेषण.(a) KAND 11 च्या दर्शविलेल्या एकाग्रतेसह एमएस प्लेट्सवर उगवलेली 7-दिवस जुनी जंगली प्रकारची कोल रोपे. स्केल बार = 1 सेमी.(b) मुळांच्या लांबीचे परिमाण.अक्षरे लक्षणीय फरक दर्शवितात (तुकी एचएसडी चाचणी, पी< ०.०५).n>16. डेटा सरासरी ± SD म्हणून दर्शविला आहे.(c) 25 μM KAND सह किंवा शिवाय एमएस प्लेट्सवर उगवलेल्या प्रोपिडियम आयोडाइड-स्टेन्ड वाइल्ड-प्रकार कोल रूट्सची कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपी 11. पांढरे कंस रूट मेरिस्टेम दर्शवतात.स्केल बार = 100 µm.(d) रूट मेरिस्टेम आकाराचे परिमाण (n = 10 ते 11).सांख्यिकीय फरक टी-टेस्ट (पी< ०.०५).बार सरासरी मेरिस्टेम आकाराचे प्रतिनिधित्व करतात.(e) CDKB2 रचना असलेल्या रूट मेरिस्टेमची डिफरेंशियल इंटरफेरन्स कॉन्ट्रास्ट (डीआयसी) मायक्रोस्कोपी;1pro: CDKB2;1-GUS स्टेन्ड आणि 5-दिवस जुन्या रोपांवर 25 µM KAND परखसह किंवा त्याशिवाय MS प्लेट्सवर उगवलेला डाग.
KAND 11 च्या फायटोटॉक्सिसिटीची आणखी एक डायकोटीलेडोनस वनस्पती, तंबाखू (निकोटियाना टॅबॅकम), आणि एक प्रमुख जमीन वनस्पती मॉडेल जीव, लिव्हरवॉर्ट (मार्चेंटिया पॉलीमॉर्फा) वापरून चाचणी केली गेली.Arabidopsis च्या बाबतीत, तंबाखू SR-1 रोपे मध्यम प्रमाणात उगवलेली 25 μM KAND 11 लहान मुळे तयार करतात (Fig. 5a).याव्यतिरिक्त, 48 पैकी 40 बिया 200 μM KAND 11 असलेल्या प्लेट्सवर अंकुरित झाल्या, तर सर्व 48 बिया मॉक-ट्रीटेड मीडियावर अंकुरित झाल्या, हे दर्शविते की KAND ची उच्च सांद्रता लक्षणीय होती (p< ०.०५;chi test -square) तंबाखूचे उगवण प्रतिबंधित करते.(Fig. 5b).याव्यतिरिक्त, लिव्हरवॉर्टमध्ये बॅक्टेरियाच्या वाढीस प्रतिबंध करणाऱ्या KAND 11 ची एकाग्रता अरेबिडोप्सिस (Fig. 5c) मधील प्रभावी एकाग्रतेसारखीच होती.हे परिणाम सूचित करतात की KAND 11 विविध प्रकारच्या वनस्पतींच्या वाढीस प्रतिबंध करू शकते.त्यानंतर आम्ही इतर जीवांमध्ये अस्वल मोनोअमाइड-संबंधित संयुगे, मानवी HeLa पेशी आणि Escherichia coli strain DH5α, अनुक्रमे उच्च प्राणी आणि जीवाणू पेशींचे प्रतिनिधी म्हणून संभाव्य सायटोटॉक्सिसिटी तपासले.पेशींच्या प्रसाराच्या परिक्षणांच्या मालिकेत, आम्ही असे निरीक्षण केले की क्यूमामोनामाइड 1, क्युमामोनामीडिक ऍसिड 6 आणि KAND 11 100 μM (चित्र 5d,e) च्या एकाग्रतेवर HeLa किंवा E. coli पेशींच्या वाढीवर परिणाम करत नाही.
अरेबिडोप्सिस नसलेल्या जीवांमध्ये KAND 11 च्या वाढीचा प्रतिबंध.(a) दोन आठवडे जुनी जंगली-प्रकार SR-1 तंबाखूची रोपे 25 μM KAND 11 असलेल्या उभ्या स्थितीत असलेल्या एमएस प्लेट्सवर वाढविण्यात आली. (b) दोन आठवड्यांची जंगली-प्रकार SR-1 तंबाखूची रोपे क्षैतिज स्थितीत उगवली गेली. एमएस प्लेट्स ज्यामध्ये 200 μM KAND 11 आहे. (c) दोन आठवडे जुन्या जंगली-प्रकार Tak-1 लिव्हरवॉर्ट कळ्या Gamborg B5 प्लेट्सवर KAND 11 च्या सूचित एकाग्रतेसह उगवतात. लाल बाण दोन आठवड्यांच्या उष्मायनात वाढणारे बीजाणू दर्शवतात कालावधी(d) HeLa पेशींचा सेल प्रसार परख.सेल काउंटिंग किट 8 (डोजिंदो) वापरून व्यवहार्य पेशींची संख्या निश्चित वेळेच्या अंतराने मोजली गेली.नियंत्रण म्हणून, HeLa पेशींवर 5 μg/ml actinomycin D (Act D) उपचार केले गेले, जे RNA पॉलिमरेझ ट्रान्सक्रिप्शनला प्रतिबंधित करते आणि पेशींच्या मृत्यूस कारणीभूत ठरते.विश्लेषण त्रिगुणांमध्ये केले गेले.(e) ई. कोलाय सेल प्रसार परख.ई. कोलायच्या वाढीचे OD600 मोजून विश्लेषण करण्यात आले.नियंत्रण म्हणून, पेशींवर 50 μg/ml अँपिसिलिन (Amp) उपचार केले गेले, जे जीवाणूंच्या सेल भिंतीचे संश्लेषण रोखते.विश्लेषण त्रिगुणांमध्ये केले गेले.
युरामाइड-संबंधित यौगिकांमुळे सायटोटॉक्सिसिटीच्या कृतीची यंत्रणा उलगडण्यासाठी, आम्ही मध्यम प्रतिबंधात्मक प्रभावांसह अर्बेनिक ऍसिड डेरिव्हेटिव्ह्जचे पुनर्विश्लेषण केले.चित्रात दाखवल्याप्रमाणे.आकृती 2b, 6a मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, urmotonic acid 6 चे उच्च सांद्रता (200 μM) असलेल्या आगर प्लेट्सवर उगवलेल्या रोपांमुळे लहान आणि डावी-वक्र मुळे (θ = – 23.7 ± 6.1) तयार होतात, तर नियंत्रण माध्यमावर उगवलेली रोपे, रोपे जवळजवळ सरळ मुळे तयार करतात (θ = – 3.8 ± 7.1).ही वैशिष्ट्यपूर्ण तिरकस वाढ कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्स 14,18 च्या बिघडलेल्या कार्यामुळे ओळखली जाते.या शोधाशी सुसंगत, मायक्रोट्यूब्यूल-अस्थिर करणारी औषधे डिसोपायरामाइड आणि ओरिझालिनने आमच्या वाढीच्या स्थितीत (अंजीर 2b, 6a) समान रूट झुकण्यास प्रेरित केले.त्याच वेळी, आम्ही urmotonic acid डेरिव्हेटिव्ह्जची चाचणी केली आणि त्यापैकी अनेक निवडले जे, विशिष्ट एकाग्रतेवर, तिरकस मुळांच्या वाढीस प्रेरित करतात.संयुगे 8, 9 आणि 15 ने अनुक्रमे 75 μM, 50 μM आणि 40 μM वर रूट वाढीची दिशा बदलली, हे दर्शविते की ही संयुगे प्रभावीपणे सूक्ष्मनलिका (Fig. 2b, 6a) अस्थिर करू शकतात.आम्ही सर्वात शक्तिशाली ursolic acid डेरिव्हेटिव्ह, KAND 11, कमी एकाग्रतेवर (15 µM) देखील तपासले आणि आढळले की KAND 11 च्या वापरामुळे मुळांच्या वाढीस प्रतिबंध होतो आणि मुळांच्या वाढीची दिशा असमान होती, जरी ते डावीकडे उताराकडे झुकत होते ( आकृती C3)..मायक्रोट्यूब्यूल-अस्थिर औषधांची उच्च सांद्रता काहीवेळा रूट झुकण्याऐवजी वनस्पतींच्या वाढीस प्रतिबंध करते, आम्ही नंतर रूट एपिडर्मल पेशींमधील कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्सचे निरीक्षण करून KAND 11 सूक्ष्मनलिका प्रभावित करते या शक्यतेचे मूल्यांकन केले.25 μM KAND 11 ने उपचार केलेल्या रोपांच्या मुळांच्या एपिडर्मल पेशींमध्ये अँटी-β-ट्यूब्युलिन ऍन्टीबॉडीजचा वापर करून इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री वाढवण्याच्या क्षेत्रामध्ये (चित्र 6b) एपिडर्मल पेशींमधील जवळजवळ सर्व कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्स गायब झाल्याचे दिसून आले.हे परिणाम सूचित करतात की कुमामोटोनिक ऍसिड आणि त्याचे डेरिव्हेटिव्ह्ज सूक्ष्म ट्यूबल्सवर प्रत्यक्ष किंवा अप्रत्यक्षपणे कार्य करतात आणि त्यांना व्यत्यय आणतात आणि ही संयुगे नवीन मायक्रोट्यूब्यूल इनहिबिटर आहेत.
उर्सोनिक ऍसिड आणि त्याचे डेरिव्हेटिव्ह्ज अरेबिडोप्सिस थालियानामधील कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्समध्ये बदल करतात.(a) दर्शविलेल्या एकाग्रतेवर विविध urmotonic acid डेरिव्हेटिव्ह्जच्या उपस्थितीत मोजलेले रूट कलते कोन.मायक्रोट्यूब्यूल्स प्रतिबंधित करण्यासाठी ओळखल्या जाणाऱ्या दोन संयुगांचे परिणाम: डिसोपायरामाइड आणि ओरिझालिन यांचे देखील विश्लेषण केले गेले.इनसेट रूट वाढीचा कोन मोजण्यासाठी वापरलेले मानक दाखवते.तारांकन हे शेम उपचारांमध्ये लक्षणीय फरक दर्शवितात (टी चाचणी, पी< ०.०५).n>19. स्केल बार = 1 सेमी.(b) विस्तार झोनमधील एपिडर्मल पेशींमधील कॉर्टिकल सूक्ष्मनलिका.25 μM KAND 11 सह किंवा शिवाय MS प्लेट्सवर वाढलेल्या जंगली-प्रकारच्या अरबीडोप्सिस कोल रूट्समधील मायक्रोट्यूब्यूल्स β-ट्यूब्युलिन प्राथमिक प्रतिपिंड आणि अलेक्सा फ्लूर-संयुग्मित दुय्यम प्रतिपिंडे वापरून इम्युनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंगद्वारे दृश्यमान होते.स्केल बार = 10 µm.(c) रूट मेरिस्टेममधील मायक्रोट्यूब्यूल्सची मायटोटिक रचना.इम्युनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंगचा वापर करून मायक्रोट्यूब्यूल्सचे चित्रण केले गेले.प्रोफेस झोन, स्पिंडल्स आणि फ्रॅगमोप्लास्ट्ससह मिटोटिक संरचना, कॉन्फोकल प्रतिमांमधून मोजल्या गेल्या.बाण माइटोटिक मायक्रोट्यूब्यूल संरचना दर्शवतात.तारांकन हे शेम उपचारांमध्ये लक्षणीय फरक दर्शवितात (टी चाचणी, पी< ०.०५).n>9. स्केल बार = 50 µm.
उर्सामध्ये मायक्रोट्यूब्यूलच्या कार्यामध्ये व्यत्यय आणण्याची क्षमता असली तरी, त्याची क्रिया करण्याची यंत्रणा विशिष्ट मायक्रोट्यूब्यूल डिपोलिमरायझिंग एजंट्सपेक्षा वेगळी असणे अपेक्षित आहे.उदाहरणार्थ, डिसोपायरामाइड आणि ओरिझालिन सारख्या मायक्रोट्यूब्यूल डिपोलिमरायझिंग एजंट्सची उच्च सांद्रता एपिडर्मल पेशींच्या एनिसोट्रॉपिक विस्तारास प्रेरित करते, तर KAND 11 असे नाही.याव्यतिरिक्त, KAND 11 आणि disopyramide च्या सह-अर्जामुळे एकत्रित disopyramide-प्रेरित रूट वाढीचा प्रतिसाद आणि KAND 11-प्रेरित वाढ प्रतिबंध दिसून आला (चित्र S4).आम्ही KAND 11 ला अतिसंवेदनशील डिसोपायरामाइड 1-1 (phs1-1) उत्परिवर्तनाच्या प्रतिसादाचे देखील विश्लेषण केले. phs1-1 मध्ये नॉन-कॅनोनिकल ट्युब्युलिन किनेज पॉइंट उत्परिवर्तन आहे आणि डिसोपायरामाइड 9,20 सह उपचार केल्यावर लहान मुळे निर्माण होतात.KAND 11 असलेल्या आगर माध्यमावर उगवलेल्या phs1-1 उत्परिवर्ती रोपांची मुळे डिसोपायरामिड (अंजीर S5) वर उगवलेल्या रोपांसारखीच लहान होती.
याव्यतिरिक्त, आम्ही KAND 11 सह उपचार केलेल्या रोपांच्या मूळ मेरिस्टेममध्ये प्रोफेस झोन, स्पिंडल्स आणि फ्रॅगमोप्लास्ट सारख्या माइटोटिक मायक्रोट्यूब्यूल संरचनांचे निरीक्षण केले. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS च्या निरीक्षणांशी सुसंगत, लक्षणीय घट माइटोटिक मायक्रोट्यूब्यूल्सची संख्या दिसून आली (चित्र .6c).
सबसेल्युलर रिझोल्यूशनवर KAND 11 ची सायटोटॉक्सिसिटी वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी, आम्ही KAND 11 सह तंबाखू BY-2 निलंबन पेशींवर उपचार केले आणि त्यांच्या प्रतिसादाचे निरीक्षण केले.कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्सवर KAND 11 च्या प्रभावाचे मूल्यांकन करण्यासाठी आम्ही प्रथम KAND 11 BY-2 पेशींमध्ये जोडले जे TagRFP-TUA6 व्यक्त करतात, जे फ्लोरोसेंटली मायक्रोट्यूब्यूल्स लेबल करतात.प्रतिमेचे विश्लेषण वापरून कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल घनतेचे मूल्यांकन केले गेले, ज्याने सायटोप्लाज्मिक पिक्सेलमधील सायटोस्केलेटल पिक्सेलची टक्केवारी मोजली.परख परिणामांनी असे दर्शवले की 50 μM किंवा 100 μM KAND 11 सह 1 तास उपचार केल्यावर, घनता अनुक्रमे 0.94 ± 0.74% किंवा 0.23 ± 0.28% पर्यंत कमी झाली, तर DMSO ने उपचार केलेल्या पेशींची घनता , 1 ± 1 ± 6.4 इतकी झाली. % (Fig. 7a).हे परिणाम Arabidopsis मधील निरीक्षणाशी सुसंगत आहेत की KAND 11 उपचाराने कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्स (Fig. 6b) चे डिपोलिमरायझेशन प्रेरित होते.आम्ही KAND 11 च्या समान एकाग्रतेसह उपचारानंतर GFP-ABD-लेबल केलेल्या ऍक्टिन फिलामेंटसह BY-2 रेषेचे परीक्षण केले आणि लक्षात आले की KAND 11 उपचाराने ऍक्टिन फिलामेंट्समध्ये व्यत्यय आणला.1 तासासाठी 50 μM किंवा 100 μM KAND 11 सह उपचार केल्याने ऍक्टिन फिलामेंटची घनता अनुक्रमे 1.20 ± 0.62% किंवा 0.61 ± 0.26% इतकी कमी झाली, तर DMSO-उपचार केलेल्या पेशींमध्ये घनता 1.69 %F ± 0.5 ± 0.69% होती.7b).हे परिणाम प्रोपायझामाइडच्या प्रभावांशी विरोधाभास करतात, जे ऍक्टिन फिलामेंट्सवर परिणाम करत नाहीत आणि लॅट्रनकुलिन बी, एक ऍक्टिन डिपोलिमेरायझर जे मायक्रोट्यूब्यूल्सवर परिणाम करत नाही (SI Figure S6).याव्यतिरिक्त, क्युमामोनामाइड 1, कूमामोनामाइड ऍसिड 6, किंवा KAND 11 सह उपचाराने HeLa पेशी (SI Figure S7) मधील सूक्ष्मनलिका प्रभावित होत नाही.अशाप्रकारे, KAND 11 ची क्रिया करण्याची यंत्रणा ज्ञात सायटोस्केलेटन विघटनकर्त्यांपेक्षा वेगळी असल्याचे मानले जाते.याशिवाय, KAND 11 सह उपचार केलेल्या BY-2 पेशींच्या आमच्या सूक्ष्म निरीक्षणातून KAND 11 उपचारादरम्यान पेशींच्या मृत्यूची सुरुवात झाल्याचे दिसून आले आणि असे दिसून आले की KAND 11 उपचारानंतर 30 मिनिटांनंतर इव्हान्स निळ्या-दागलेल्या मृत पेशींचे प्रमाण लक्षणीय वाढले नाही. 50 μM किंवा 100 μM KAND सह 90 मिनिटांच्या उपचारानंतर, मृत पेशींची संख्या अनुक्रमे 43.7% किंवा 80.1% पर्यंत वाढली (चित्र 7c).एकत्रितपणे, हे डेटा सूचित करतात की कादंबरी ursolic acid डेरिव्हेटिव्ह KAND 11 एक वनस्पती-विशिष्ट साइटोस्केलेटल इनहिबिटर आहे ज्यामध्ये क्रिया करण्याची पूर्वी अज्ञात यंत्रणा आहे.
KAND कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्स, ऍक्टिन फिलामेंट्स आणि तंबाखू BY-2 पेशींच्या व्यवहार्यतेवर परिणाम करते.(a) TagRFP-TUA6 च्या उपस्थितीत BY-2 पेशींमध्ये कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्सचे व्हिज्युअलायझेशन.KAND 11 (50 μM किंवा 100 μM) किंवा DMSO सह उपचार केलेल्या BY-2 पेशींचे कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपीद्वारे परीक्षण केले गेले.कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल घनता 25 स्वतंत्र पेशींच्या मायक्रोग्राफमधून मोजली गेली.अक्षरे लक्षणीय फरक दर्शवितात (तुकी एचएसडी चाचणी, पी< ०.०५).स्केल बार = 10 µm.(b) BY-2 पेशींमधील कॉर्टिकल ऍक्टिन फिलामेंट्स GFP-ABD2 च्या उपस्थितीत दृश्यमान होतात.KAND 11 (50 μM किंवा 100 μM) किंवा DMSO सह उपचार केलेल्या BY-2 पेशींचे कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपीद्वारे परीक्षण केले गेले.कॉर्टिकल ऍक्टिन फिलामेंट्सची घनता 25 स्वतंत्र पेशींच्या मायक्रोग्राफमधून मोजली गेली.अक्षरे लक्षणीय फरक दर्शवितात (तुकी एचएसडी चाचणी, पी< ०.०५).स्केल बार = 10 µm.(c) इव्हान्स ब्लू स्टेनिंगद्वारे मृत BY-2 पेशींचे निरीक्षण.KAND 11 (50 μM किंवा 100 μM) किंवा DMSO सह उपचार केलेल्या BY-2 पेशींची ब्राइट-फील्ड मायक्रोस्कोपीद्वारे तपासणी केली गेली.n=3.स्केल बार = 100 µm.
नवीन नैसर्गिक उत्पादनांचा शोध आणि वापरामुळे औषध आणि शेतीसह मानवी जीवनाच्या विविध पैलूंमध्ये लक्षणीय प्रगती झाली आहे.नैसर्गिक संसाधनांमधून उपयुक्त संयुगे मिळविण्यासाठी ऐतिहासिक संशोधन केले गेले आहे.विशेषतः, ऍव्हरमेक्टिन आणि ब्लीओमायसिनचे लीड कंपाऊंड, ऍव्हरमेक्टिन यांसारख्या विविध दुय्यम चयापचयांची निर्मिती करण्याच्या क्षमतेमुळे आणि त्याचे डेरिव्हेटिव्हज, ज्याचा उपयोग कर्करोगविरोधी एजंट 21,22 म्हणून औषधी पद्धतीने केला जातो त्यामुळे ऍक्टिनोमायसीट्स हे नेमाटोड्ससाठी अँटीपॅरासिटिक प्रतिजैविक म्हणून उपयुक्त आहेत.त्याचप्रमाणे, ऍक्टिनोमायसीट्सपासून विविध तणनाशक संयुगे शोधण्यात आले आहेत, त्यापैकी काही आधीच व्यावसायिकरित्या 1,23 वापरल्या जात आहेत.म्हणून, इच्छित जैविक क्रियाकलापांसह नैसर्गिक उत्पादनांना वेगळे करण्यासाठी ऍक्टिनोमायसीट मेटाबोलाइट्सचे विश्लेषण प्रभावी धोरण मानले जाते.या अभ्यासात, आम्ही S. werraensis कडून एक नवीन कंपाऊंड, coumamonamide शोधून काढला आणि त्याचे यशस्वीरित्या संश्लेषण केले.उर्सोनिक ऍसिड हे अर्बेनामाइड आणि त्याच्या डेरिव्हेटिव्ह्जचे सिंथेटिक इंटरमीडिएट आहे.हे वैशिष्ट्यपूर्ण रूट कर्लिंग होऊ शकते, मध्यम ते मजबूत तणनाशक क्रिया दर्शवू शकते आणि प्रत्यक्ष किंवा अप्रत्यक्षपणे वनस्पती सूक्ष्मनलिका नुकसान करू शकते.तथापि, urmotonic ऍसिडची क्रिया करण्याची यंत्रणा विद्यमान मायक्रोट्यूब्यूल इनहिबिटरपेक्षा भिन्न असू शकते, कारण KAND 11 देखील ऍक्टिन फिलामेंट्समध्ये व्यत्यय आणते आणि पेशींच्या मृत्यूस कारणीभूत ठरते, एक नियामक यंत्रणा सुचवते ज्याद्वारे urmotonic ऍसिड आणि त्याचे डेरिव्हेटिव्ह साइटोस्केलेटल संरचनांच्या विस्तृत श्रेणीवर प्रभाव पाडतात..
urbenonic acid च्या पुढील तपशीलवार वर्णनामुळे urbenonic acid च्या कृतीची यंत्रणा अधिक चांगल्या प्रकारे समजण्यास मदत होईल.विशेषतः, उर्सोनिक ऍसिड आणि त्याचे डेरिव्हेटिव्ह थेट मायक्रोट्यूब्यूल्सवर कार्य करतात आणि त्यांचे डिपॉलिमराइज करतात किंवा त्यांच्या कृतीमुळे मायक्रोट्यूब्यूल अस्थिरतेत होते की नाही हे निर्धारित करण्यासाठी कमी केलेल्या सूक्ष्मनलिकांशी बांधण्यासाठी ursonic ऍसिडच्या क्षमतेचे मूल्यांकन करणे हे पुढील लक्ष्य आहे.याव्यतिरिक्त, सूक्ष्मनलिका थेट लक्ष्य नसलेल्या बाबतीत, वनस्पतीच्या पेशींवरील उर्सोनिक ऍसिडचे कृतीचे ठिकाण आणि आण्विक लक्ष्य ओळखणे संबंधित संयुगेचे गुणधर्म आणि तणनाशक क्रियाकलाप सुधारण्याचे संभाव्य मार्ग समजून घेण्यास मदत करेल.आमच्या बायोॲक्टिव्हिटी परखने अरॅबिडोप्सिस थालियाना, तंबाखू आणि लिव्हरवॉर्ट सारख्या वनस्पतींच्या वाढीवर उर्सोनिक ऍसिडची अद्वितीय साइटोटॉक्सिक क्षमता प्रकट केली, तर E. coli किंवा HeLa पेशींवर परिणाम झाला नाही.जर ते खुल्या शेतीच्या शेतात वापरण्यासाठी तणनाशक म्हणून विकसित केले गेले तर प्राण्यांच्या पेशींना कमी किंवा कमी विषारीपणा हा ursonic acid डेरिव्हेटिव्हचा फायदा आहे.खरंच, युकेरियोट्समध्ये मायक्रोट्यूब्यूल्स ही सामान्य रचना असल्याने, वनस्पतींमध्ये त्यांचे निवडक प्रतिबंध ही तणनाशकांसाठी मुख्य आवश्यकता आहे.उदाहरणार्थ, प्रोपायझामाइड, एक मायक्रोट्यूब्यूल डिपोलिमरायझिंग एजंट जो थेट ट्युब्युलिनला बांधतो आणि पॉलिमरायझेशन प्रतिबंधित करतो, प्राण्यांच्या पेशींमध्ये कमी विषाक्ततेमुळे तणनाशक म्हणून वापरला जातो24.डिसोपायरामाइडच्या विरूद्ध, संबंधित बेंझामाइड्समध्ये भिन्न लक्ष्य वैशिष्ट्ये आहेत.वनस्पती सूक्ष्मनलिका व्यतिरिक्त, RH-4032 किंवा बेंझोक्सामाइड अनुक्रमे प्राण्यांच्या पेशी किंवा oomycetes च्या सूक्ष्मनलिका प्रतिबंधित करते आणि झालिलामाइड 25,26,27 कमी फायटोटॉक्सिसिटीमुळे बुरशीनाशक म्हणून वापरले जाते.नव्याने सापडलेले अस्वल आणि त्याचे डेरिव्हेटिव्ह्ज वनस्पतींविरूद्ध निवडक सायटोटॉक्सिसिटी प्रदर्शित करतात, परंतु हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की पुढील सुधारणा त्यांच्या लक्ष्य विशिष्टतेत बदल करू शकतात, संभाव्यत: रोगजनक बुरशी किंवा oomycetes च्या नियंत्रणासाठी अतिरिक्त डेरिव्हेटिव्ह प्रदान करतात.
अर्बेनोनिक ऍसिडचे अद्वितीय गुणधर्म आणि त्याचे डेरिव्हेटिव्ह हे तणनाशक म्हणून त्यांच्या विकासासाठी आणि संशोधन साधने म्हणून वापरण्यासाठी उपयुक्त आहेत.वनस्पती पेशींचा आकार नियंत्रित करण्यासाठी सायटोस्केलेटनचे महत्त्व सर्वत्र ओळखले जाते.पूर्वीच्या अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की वनस्पतींनी मॉर्फोजेनेसिस योग्यरित्या नियंत्रित करण्यासाठी मायक्रोट्यूब्यूल डायनॅमिक्स नियंत्रित करून कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल संस्थेची जटिल यंत्रणा विकसित केली आहे.मायक्रोट्यूब्यूल क्रियाकलापांच्या नियमनासाठी जबाबदार असलेल्या मोठ्या प्रमाणात रेणू ओळखले गेले आहेत आणि संबंधित संशोधन अद्याप चालू आहे 3,4,28.वनस्पती पेशींमधील मायक्रोट्यूब्यूल डायनॅमिक्सची आमची सध्याची समज कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल संस्थेची यंत्रणा पूर्णपणे स्पष्ट करत नाही.उदाहरणार्थ, जरी डिसोपायरामाइड आणि ओरिझालिन दोन्ही मायक्रोट्यूब्यूल्स डिपोलिमराइज करू शकतात, डिसोपायरामाइडमुळे तीव्र मूळ विकृती होते तर ओरिझालिनचा तुलनेने सौम्य प्रभाव असतो.शिवाय, ट्युब्युलिनमधील उत्परिवर्तन, जे सूक्ष्मनलिका स्थिर करते, ते देखील मुळांमध्ये डेक्सट्रोरोटेशन घडवून आणतात, तर पॅक्लिटाक्सेल, जे मायक्रोट्यूब्यूल गतिशीलता देखील स्थिर करते, तसे होत नाही.म्हणून, ursolic acid च्या आण्विक लक्ष्यांचा अभ्यास करणे आणि ओळखणे, वनस्पती कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्सच्या नियमनाबद्दल नवीन अंतर्दृष्टी प्रदान करते.त्याचप्रमाणे, डिसोपायरामाइड सारख्या विकृत वाढीला चालना देण्यासाठी प्रभावी असलेल्या रसायनांची भविष्यातील तुलना आणि कमी प्रभावी रसायने, जसे की ओरिझालिन किंवा कुमामोटोरिक ऍसिड, विकृत वाढ कशी होते याचे संकेत देईल.
दुसरीकडे, संरक्षण-संबंधित साइटोस्केलेटल पुनर्रचना ही ursonic acid च्या सायटोटॉक्सिसिटीचे स्पष्टीकरण देण्याची आणखी एक शक्यता आहे.रोगजनकांच्या संसर्गामुळे किंवा वनस्पतीच्या पेशींमध्ये एलिसीटरचा प्रवेश केल्यामुळे कधीकधी सायटोस्केलेटनचा नाश होतो आणि त्यानंतरच्या पेशींचा मृत्यू होतो29.उदाहरणार्थ, oomycete-व्युत्पन्न क्रिप्टोक्सॅन्थिन तंबाखूच्या पेशींच्या मृत्यूपूर्वी मायक्रोट्यूब्यूल्स आणि ऍक्टिन फिलामेंट्समध्ये व्यत्यय आणत असल्याचे नोंदवले गेले आहे, जे KAND उपचार 30,31 प्रमाणे होते.ursonic acid द्वारे प्रेरित संरक्षण प्रतिसाद आणि सेल्युलर प्रतिसाद यांच्यातील साम्य आम्हाला असे गृहित धरण्यास प्रवृत्त केले की ते सामान्य सेल्युलर प्रक्रियांना चालना देतात, जरी क्रिप्टोक्सॅन्थिन पेक्षा उर्सोनिक ऍसिडचा वेगवान आणि मजबूत प्रभाव स्पष्ट आहे.तथापि, अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की ऍक्टिन फिलामेंट्समध्ये व्यत्यय उत्स्फूर्त पेशींच्या मृत्यूस प्रोत्साहन देते, जे नेहमी मायक्रोट्यूब्यूल व्यत्यय 29 सोबत नसते.याव्यतिरिक्त, हे पाहणे बाकी आहे की एकतर रोगजनक किंवा एलिसीटरमुळे विकृत मुळांची वाढ होते, जसे की ursonic acid डेरिव्हेटिव्ह्स करतात.अशाप्रकारे, संरक्षण प्रतिसाद आणि सायटोस्केलेटन यांना जोडणारे आण्विक ज्ञान ही एक आकर्षक समस्या आहे ज्याकडे लक्ष दिले पाहिजे.ursonic acid शी संबंधित कमी आण्विक वजन संयुगे, तसेच विविध क्षमता असलेल्या डेरिव्हेटिव्ह्जच्या उपस्थितीचे शोषण करून, ते अज्ञात सेल्युलर यंत्रणांना लक्ष्य करण्याच्या संधी प्रदान करू शकतात.
एकत्रितपणे, मायक्रोट्यूब्यूल डायनॅमिक्स सुधारित करणाऱ्या नवीन संयुगांचा शोध आणि वापर वनस्पती पेशींच्या आकाराचे निर्धारण करणाऱ्या जटिल आण्विक यंत्रणांना संबोधित करण्यासाठी शक्तिशाली पद्धती प्रदान करेल.या संदर्भात, नुकतेच विकसित झालेले संयुग उर्मोटोनिक ऍसिड, जे मायक्रोट्यूब्यूल आणि ऍक्टिन फिलामेंट्सवर परिणाम करते आणि पेशींच्या मृत्यूस कारणीभूत ठरते, मायक्रोट्यूब्यूल नियंत्रण आणि या इतर यंत्रणांमधील कनेक्शनचा उलगडा करण्याची संधी देऊ शकते.अशा प्रकारे, urbenonic ऍसिड वापरून रासायनिक आणि जैविक विश्लेषण आम्हाला वनस्पती साइटोस्केलेटन नियंत्रित करणार्या आण्विक नियामक यंत्रणा समजून घेण्यास मदत करेल.
S. werraensis MK493-CF1 ला 500 mL चकित केलेल्या Erlenmeyer फ्लास्कमध्ये 110 mL बियाणे मध्यम ज्यामध्ये 2% (w/v) गॅलेक्टोज, 2% (w/v) एसेन्स पेस्ट, 1% (w/v) बॅक्टो कंपोझिशन असते. .-सोयटन (थर्मो फिशर सायंटिफिक, इंक.), 0.5% (w/v) कॉर्न अर्क (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 आणि 0.2% CaCO3 विआयनीकृत पाण्यात.(निर्जंतुकीकरणापूर्वी pH 7.4).बियाणे कल्चर रोटरी शेकर (180 rpm) वर 27 डिग्री सेल्सिअस तापमानात 2 दिवस उबवले गेले.सॉलिड स्टेट किण्वन द्वारे उत्पादन लागवड.बियाणे संवर्धन (7 मिली) 500 मिली K-1 फ्लास्कमध्ये हस्तांतरित केले गेले ज्यामध्ये 40 ग्रॅम उत्पादन माध्यम आहे ज्यामध्ये 15 ग्रॅम दाबलेले बार्ली (MUSO Co., Li., Japan) आणि 25 ग्रॅम विआयनीकृत पाणी (पीएच समायोजित केले नाही. नसबंदी करण्यापूर्वी).).14 दिवस अंधारात 30 डिग्री सेल्सिअस तापमानात आंबायला ठेवा.किण्वन सामग्री 40 मिली/बाटली EtOH आणि सेंट्रीफ्यूज (1500 ग्रॅम, 4°C, 10 मि) सह काढली गेली.कल्चर सुपरनॅटंट (60 मिली) 10% MeOH/EtOAc च्या मिश्रणाने काढले गेले.अवशेष (59.5 मिग्रॅ) मिळविण्यासाठी कमी दाबाने सेंद्रिय स्तराचे बाष्पीभवन करण्यात आले, ज्याला रिव्हर्स फेज कॉलम (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID) वर ग्रेडियंट इल्युशन (0-10 मिनिटे: 90%) सह एचपीएलसीच्या अधीन केले गेले. 10 मिमी × लांबी 250 मिमी) H2O/CH3CN, 10-35 मिनिटे: 90% H2O/CH3CN ते 70% H2O/CH3CN (ग्रेडियंट), 35-45 मिनिटे: 90% H2O/EtOH, 45-155 मिनिटे: 90% HO2 /EtOH ते 100% EtOH (ग्रेडियंट (ग्रेडियंट), 155-200 मि: 100% EtOH) 1.5 मिली/मिनिटे प्रवाह दराने, कूमामोनामाइड (1, 36.0 मिग्रॅ) पांढरे आकारहीन पावडर म्हणून वेगळे केले गेले.
कुमामोटोमाइड (1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ गणना केलेले मूल्य: 141.0659, मोजलेले मूल्य: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1573 सेमी.
कोलंबिया बियाणे (Col-0) हे अरबीडोप्सिस बायोलॉजिकल रिसोर्स सेंटर (ABRC) कडून संशोधन वापरासाठी परवानगी घेऊन प्राप्त केले गेले.आमच्या प्रयोगशाळेच्या परिस्थितीत Col-0 बियांचा प्रसार आणि देखभाल केली गेली आणि जंगली-प्रकारच्या अरेबिडोप्सिस वनस्पती म्हणून वापरली गेली.अरबीडोप्सिस बियाणे पृष्ठभागावर निर्जंतुकीकरण केले गेले आणि अर्ध-शक्तीच्या मुराशिगे आणि स्कूग माध्यमात 2% सुक्रोज (फुजीफिल्म वाको प्युअर केमिकल), 0.05% (w/v) 2- (4-मॉर्फोलिनो) इथेनेसल्फोनिक ऍसिड (एमईएस) (फुजीफिल्म वाको प्युअर चेमिकल) होते. ).) आणि 1.5% आगर (फुजीफिल्म वाको प्युअर केमिकल), pH 5.7, 23 °C आणि सतत प्रकाश.टी. हाशिमोटो (नारा इन्स्टिट्यूट ऑफ सायन्स अँड टेक्नॉलॉजी) द्वारे phs1-1 उत्परिवर्तनाचे बियाणे प्रदान केले गेले.
टी. हाशिमोटो (नारा इन्स्टिट्यूट ऑफ सायन्स अँड टेक्नॉलॉजी) द्वारे SR-1 स्ट्रेनचे बियाणे प्रदान केले गेले आणि जंगली-प्रकारच्या तंबाखू वनस्पती म्हणून वापरले गेले.तंबाखूच्या बिया पृष्ठभागावर निर्जंतुक केल्या जातात आणि उगवण वाढवण्यासाठी निर्जंतुक पाण्यात तीन रात्री भिजवून ठेवल्या जातात, नंतर 2% सुक्रोज, 0.05% (w/v) MES आणि 0.8% जेलन गम (फुजीफिल्म वाको प्युअर केमिकल) असलेल्या अर्ध्या ताकदीच्या द्रावणात ठेवल्या जातात. मुराशिगे.आणि स्कूग मध्यम) pH 5.7 सह आणि स्थिर प्रकाशात 23°C वर उष्मायन केले जाते.
टी. कोहची (क्योटो युनिव्हर्सिटी) द्वारे स्ट्रेन टक-1 प्रदान केला गेला आणि लिव्हरवॉर्ट अभ्यासासाठी मानक प्रायोगिक एकक म्हणून वापरला गेला.जेम्मा निर्जंतुकीकरण केलेल्या संवर्धित वनस्पतींमधून मिळवले गेले आणि नंतर 1% सुक्रोज आणि 0.3% जेलन गम असलेले गॅम्बोर्ग B5 माध्यम (फुजीफिल्म वाको प्युअर केमिकल) वर प्लेट केले गेले आणि सतत प्रकाशात 23°C वर उबवले गेले.
तंबाखू BY-2 पेशी (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) S. Hasezawa (टोकियो विद्यापीठ) यांनी प्रदान केल्या होत्या.BY-2 पेशी सुधारित Linsmeier आणि Skoog माध्यमात 95-पट पातळ केल्या गेल्या आणि 2,4-डायक्लोरोफेनोक्सायसेटिक ऍसिड 32 सह साप्ताहिक पूरक केले गेले.सेल सस्पेंशन एका रोटरी शेकरवर 130 rpm वर 27°C वर अंधारात मिसळले गेले.ताज्या माध्यमाच्या 10 पट व्हॉल्यूमसह सेल धुवा आणि त्याच माध्यमात पुन्हा सस्पेंड करा.फुलकोबी मोझॅक व्हायरस 35S प्रमोटर अंतर्गत मायक्रोट्यूब्यूल मार्कर TagRFP-TUA6 किंवा ऍक्टिन फिलामेंट मार्कर GFP-ABD2 यांना स्थिरपणे व्यक्त करणाऱ्या BY-2 ट्रान्सजेनिक सेल लाईन्स 33,34,35 वर्णन केल्याप्रमाणे तयार केल्या गेल्या.मूळ BY-2 सेल लाइनसाठी वापरल्या जाणाऱ्या प्रक्रियांप्रमाणेच या सेल लाइन्स राखल्या जाऊ शकतात आणि सिंक्रोनाइझ केल्या जाऊ शकतात.
हेला पेशी डल्बेकोच्या सुधारित गरुड माध्यम (DMEM) (लाइफ टेक्नॉलॉजीज) मध्ये 10% गर्भाच्या बोवाइन सीरम, 1.2 U/ml पेनिसिलिन आणि 1.2 μg/ml स्ट्रेप्टोमायसिनसह 37°C %2 इनक्यूबेटरमध्ये संवर्धन करण्यात आल्या.
या हस्तलिखितात वर्णन केलेले सर्व प्रयोग जपानी जैवसुरक्षा नियम आणि मार्गदर्शक तत्त्वांनुसार केले गेले.
डायमिथाइल सल्फॉक्साइड (DMSO; फुजीफिल्म वाको प्युअर केमिकल) मध्ये संयुगे स्टॉक सोल्यूशन म्हणून विरघळली गेली आणि अरबीडोप्सिस आणि तंबाखूसाठी एमएस माध्यमात किंवा लिव्हरवॉर्टसाठी गॅम्बोर्ग बी5 माध्यमात पातळ केली गेली.मुळांच्या वाढीच्या प्रतिबंधक तपासणीसाठी, सूचित संयुगे किंवा DMSO असलेल्या आगर माध्यमावर प्रति प्लेट 10 पेक्षा जास्त बिया पेरल्या गेल्या.बियाणे 7 दिवस ग्रोथ चेंबरमध्ये उबवले गेले.रोपांची छायाचित्रे काढण्यात आली आणि मुळांची लांबी मोजली गेली.अरेबिडोप्सिस उगवण तपासणीसाठी, 200 μM कंपाऊंड किंवा DMSO असलेल्या आगर माध्यमावर प्रति प्लेट 48 बिया पेरल्या गेल्या.अरेबिडोप्सिस बियाणे ग्रोथ चेंबरमध्ये उगवले गेले आणि अंकुरित रोपांची संख्या उगवण (डेग) नंतर 7 दिवसांनी मोजली गेली.तंबाखूच्या उगवण तपासणीसाठी, 200 μM KAND किंवा DMSO असलेल्या आगर माध्यमावर प्रति प्लेट 24 बिया पेरल्या गेल्या.तंबाखूच्या बिया एका ग्रोथ चेंबरमध्ये उगवल्या गेल्या आणि 14 दिवसांनी अंकुरित रोपांची संख्या मोजली गेली.लिव्हरवॉर्ट ग्रोथ इनहिबिशन तपासणीसाठी, प्रत्येक प्लेटमधील 9 भ्रूण आगर माध्यमावर प्लेट केले गेले होते ज्यात KAND किंवा DMSO ची सूचित सांद्रता होती आणि 14 दिवस ग्रोथ चेंबरमध्ये उबवले होते.
5 mg/ml propidium iodide (PI) ने डागलेली रोपे रूट मेरिस्टेम ऑर्गनायझेशनसाठी वापरा.TCS SPE कॉन्फोकल लेसर स्कॅनिंग मायक्रोस्कोप (Leica Microsystems) वापरून फ्लोरोसेन्स मायक्रोस्कोपीद्वारे PI सिग्नलचे निरीक्षण केले गेले.
β-glucuronidase (GUS) सह मुळांचे हिस्टोकेमिकल डाग मलामी आणि Benfey36 यांनी वर्णन केलेल्या प्रोटोकॉलनुसार केले गेले.रोपे रात्रभर 90% एसीटोनमध्ये निश्चित केली गेली, 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid सह डाग GUS बफरमध्ये 1 तासासाठी आणि हायड्रेटेड क्लोराल्डिहाइड द्रावणात ठेवले.(8 ग्रॅम क्लोरल हायड्रेट, 2 मिली पाणी आणि 1 मिली ग्लिसरॉल) आणि एक्सिओ इमेजर एम1 मायक्रोस्कोप (कार्ल झीस) वापरून विभेदक हस्तक्षेप कॉन्ट्रास्ट मायक्रोस्कोपीद्वारे निरीक्षण केले.
उभ्या ठेवलेल्या प्लेट्सवर उगवलेल्या 7-दिवसांच्या रोपांवर रूट कोन मोजले गेले.पायरी 6 मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे गुरुत्वाकर्षण वेक्टरच्या दिशेपासून रूटचा कोन मोजा.
प्रोटोकॉल 37 मध्ये किरकोळ बदलांसह, कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्सची व्यवस्था वर्णन केल्याप्रमाणे दिसून आली.अँटी-बीटा-ट्यूब्युलिन अँटीबॉडी (KMX-1, मर्क मिलिपोर: MAB3408) आणि Alexa Fluor 488-संयुग्मित अँटी-माऊस IgG (थर्मो फिशर सायंटिफिक: A32723) प्राथमिक आणि दुय्यम प्रतिपिंडे म्हणून 1:1000 आणि 1:100 डायल्युशन, अनुक्रमेTCS SPE कॉन्फोकल लेसर स्कॅनिंग मायक्रोस्कोप (Leica Microsystems) वापरून फ्लूरोसेन्स प्रतिमा प्राप्त केल्या गेल्या.Z-स्टॅक प्रतिमा मिळवा आणि निर्मात्याच्या सूचनांनुसार जास्तीत जास्त तीव्रतेचे अंदाज तयार करा.
सेल काउंटिंग किट 8 (डोजिंडो) वापरून उत्पादकाच्या सूचनेनुसार HeLa सेल प्रसार तपासणी केली गेली.
600 nm (OD600) वर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर वापरून संस्कृतीत सेल घनता मोजून E. coli DH5α च्या वाढीचे विश्लेषण केले गेले.
ट्रान्सजेनिक BY-2 पेशींमधील सायटोस्केलेटल संस्था CSU-X1 कॉन्फोकल स्कॅनिंग उपकरण (योकोगावा) आणि एक sCMOS कॅमेरा (Zyla, Andor तंत्रज्ञान) ने सुसज्ज फ्लोरोसेन्स मायक्रोस्कोप वापरून पाहण्यात आली.साइटोस्केलेटल घनतेचे मूल्यांकन प्रतिमा विश्लेषणाद्वारे केले गेले, ज्याने 38,39 वर्णन केल्याप्रमाणे इमेजजे सॉफ्टवेअर वापरून कॉन्फोकल प्रतिमांमधील सायटोप्लाज्मिक पिक्सेलमधील साइटोस्केलेटल पिक्सेलची टक्केवारी मोजली.
BY-2 पेशींमध्ये पेशींचा मृत्यू शोधण्यासाठी, सेल सस्पेंशनचा एक अलिकट खोलीच्या तापमानावर 0.05% इव्हान्स ब्लू सह 10 मिनिटांसाठी उष्मायन करण्यात आला.मृत पेशींचे निवडक इव्हान्स निळे डाग अखंड प्लाझ्मा झिल्लीद्वारे व्यवहार्य पेशींमधून रंग बाहेर काढण्यावर अवलंबून असतात.ब्राइट-फील्ड मायक्रोस्कोप (BX53, Olympus) वापरून स्टेन्ड पेशींचे निरीक्षण केले गेले.
HeLa पेशी DMEM मध्ये 10% FBS सह 37°C आणि 5% CO2 वर आर्द्रता असलेल्या इनक्यूबेटरमध्ये वाढविण्यात आल्या.पेशींवर 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), किंवा 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) 37°C तापमानावर 6 तासांसाठी उपचार केले गेले.पेशी 10 मिनिटांसाठी MetOH सह आणि नंतर खोलीच्या तपमानावर 5 मिनिटांसाठी एसीटेटसह निश्चित केल्या गेल्या.स्थिर पेशी β-ट्यूब्युलिन प्राइमरी अँटीबॉडी (1D4A4, प्रोटीनटेक: 66240-1) 0.5% BSA/PBS मध्ये 2 तासांसाठी पातळ केल्या, TBST ने 3 वेळा धुतल्या आणि नंतर अलेक्सा फ्लोर बकरी प्रतिपिंडाने उष्मायन केल्या.488 1 तास.- माउस IgG (थर्मो फिशर सायंटिफिक: A11001) आणि 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 0.5% BSA/PBS मध्ये पातळ केले.TBST ने तीन वेळा धुतल्यानंतर, Nikon Eclipse Ti-E इनव्हर्टेड मायक्रोस्कोपवर डाग असलेल्या पेशी आढळून आल्या.मेटामॉर्फ सॉफ्टवेअर (मॉलेक्युलर डिव्हाइसेस) वापरून थंड हमामात्सु ORCA-R2 CCD कॅमेऱ्याने प्रतिमा कॅप्चर केल्या गेल्या.
पोस्ट वेळ: जून-17-2024