वनस्पतींच्या मायक्रोट्यूब्यूल्सवर परिणाम करणारे नवीन वनस्पती वाढ रोधक म्हणून उर्सा मोनोअमाइड्सचा शोध, वैशिष्ट्यीकरण आणि कार्यात्मक सुधारणा.

Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझरच्या आवृत्तीमध्ये CSS साठी मर्यादित सपोर्ट आहे. सर्वोत्तम परिणामांसाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही तुमच्या ब्राउझरची नवीन आवृत्ती वापरावी (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमधील कॉम्पॅटिबिलिटी मोड अक्षम करावा). यादरम्यान, सतत सपोर्ट सुरू ठेवण्यासाठी, आम्ही ही साइट स्टायलिंग किंवा जावास्क्रिप्टशिवाय दाखवत आहोत.
नैसर्गिक उत्पादनांचा शोध आणि त्यांचा फायदेशीर वापर मानवी जीवन सुधारण्यास मदत करू शकतो. तण नियंत्रणासाठी वनस्पतींची वाढ रोखणारी रसायने तणनाशक म्हणून मोठ्या प्रमाणावर वापरली जातात. विविध प्रकारच्या तणनाशकांच्या वापराच्या गरजेमुळे, नवीन कार्यप्रणाली असलेल्या संयुगांना ओळखण्याची आवश्यकता आहे. या अभ्यासात, आम्ही स्ट्रेप्टोमायसेस वेरेन्सिस MK493-CF1 पासून कौमामोनामाइड नावाचे एक नवीन N-अल्कोक्सीपायरोल संयुग शोधले आणि त्याची संपूर्ण संश्लेषण प्रक्रिया स्थापित केली. जैविक क्रियाकलाप चाचण्यांद्वारे, आम्हाला आढळले की अर्स-मोनोअ‍ॅमिक आम्ल हे अर्स-मोनोअमाइडचे एक संश्लेषणात्मक मध्यवर्ती आणि एक संभाव्यवनस्पती वाढ प्रतिबंधकयाव्यतिरिक्त, आम्ही विविध अर्बेनोनिक ॲसिड डेरिव्हेटिव्ह्ज विकसित केले आहेत, ज्यात अर्बेनीलॉक्सी डेरिव्हेटिव्ह (UDA) चा समावेश आहे, जे HeLa पेशींच्या वाढीवर कोणताही नकारात्मक परिणाम न करता उच्च तणनाशक क्रियाशीलता दर्शवते. आम्हाला असेही आढळले की अर्मोटोनिक ॲसिड डेरिव्हेटिव्ह्ज वनस्पतींच्या मायक्रोट्यूब्यूल्सना विस्कळीत करतात; याव्यतिरिक्त, KAND ॲक्टिन फिलामेंट्सवर परिणाम करते आणि पेशींचा मृत्यू घडवून आणते; हे बहुआयामी परिणाम ज्ञात मायक्रोट्यूब्यूल अवरोधकांच्या परिणामांपेक्षा वेगळे आहेत आणि अर्सोनिक ॲसिडच्या कार्याची एक नवीन यंत्रणा सुचवतात, जे नवीन तणनाशकांच्या विकासात एक महत्त्वाचा फायदा दर्शवते.
फायदेशीर नैसर्गिक उत्पादने आणि त्यांच्यापासून बनवलेल्या पदार्थांचा शोध आणि व्यावहारिक उपयोग हे मानवी जीवनाची गुणवत्ता सुधारण्याचे एक साधन आहे. सूक्ष्मजीव, वनस्पती आणि कीटकांद्वारे उत्पादित दुय्यम चयापचय पदार्थांमुळे वैद्यकशास्त्र आणि कृषी क्षेत्रात मोठी प्रगती झाली आहे. अनेक प्रतिजैविके आणि ल्युकेमियावरील औषधे नैसर्गिक उत्पादनांपासून विकसित केली गेली आहेत. याव्यतिरिक्त, विविध प्रकारच्याकीटकनाशकेशेतीमध्ये वापरण्यासाठी या नैसर्गिक उत्पादनांमधून बुरशीनाशके आणि तणनाशके काढली जातात. विशेषतः, आधुनिक शेतीमध्ये पिकांचे उत्पन्न वाढवण्यासाठी तण नियंत्रक तणनाशके ही महत्त्वाची साधने आहेत आणि विविध प्रकारची संयुगे आधीच व्यावसायिकरित्या वापरली जात आहेत. वनस्पतींमधील अनेक पेशीय प्रक्रिया, जसे की प्रकाशसंश्लेषण, अमिनो आम्ल चयापचय, पेशीभित्ती संश्लेषण, मायटोसिसचे नियमन, फायटोहार्मोन सिग्नलिंग किंवा प्रथिने संश्लेषण, ही तणनाशकांची सामान्य लक्ष्ये मानली जातात. मायक्रोट्यूब्यूलच्या कार्याला प्रतिबंध करणारी संयुगे ही तणनाशकांचा एक सामान्य वर्ग आहे, जी मायटोटिक नियमनावर परिणाम करून वनस्पतींच्या वाढीवर परिणाम करतात².
मायक्रोट्यूब्यूल्स हे सायटोस्केलेटनचे घटक आहेत आणि ते युकेरियोटिक पेशींमध्ये मोठ्या प्रमाणावर आढळतात. ट्युब्युलिन हेटेरोडायमरमध्ये α-ट्युब्युलिन आणि β-ट्युब्युलिनपासून रेखीय मायक्रोट्यूब्यूल प्रोटोफिलामेंट्स तयार होतात, ज्यात १३ प्रोटोफिलामेंट्स मिळून एक दंडगोलाकार रचना तयार होते. वनस्पती पेशींमध्ये मायक्रोट्यूब्यूल्स अनेक भूमिका बजावतात, ज्यात पेशींचा आकार निश्चित करणे, पेशी विभाजन आणि आंतरपेशीय वहन यांचा समावेश आहे³,⁴. वनस्पती पेशींमध्ये इंटरफेज प्लाझ्मा मेम्ब्रेनच्या खाली मायक्रोट्यूब्यूल्स असतात, आणि हे तथाकथित कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्स सेल्युलोज सिंथेस कॉम्प्लेक्सच्या नियमनाद्वारे सेल्युलोज मायक्रोफायब्रिल्सच्या रचनेवर नियंत्रण ठेवतात असे मानले जाते⁴,⁵. मुळाच्या टोकाच्या जलद लांबी वाढण्याच्या क्षेत्रात असलेल्या मुळाच्या बाह्यत्वचा पेशींचे कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्स बाजूला स्थित असतात, आणि सेल्युलोज मायक्रोफायबर्स या मायक्रोट्यूब्यूल्सच्या मागे जातात व पेशींच्या विस्ताराची दिशा मर्यादित करतात, ज्यामुळे विषमदिश पेशी लांबी वाढीस प्रोत्साहन मिळते. म्हणून, मायक्रोट्यूब्यूलचे कार्य वनस्पतींच्या आकारविज्ञानाशी जवळून संबंधित आहे. ट्युब्युलिनसाठी कोड करणाऱ्या जनुकांमधील अमिनो आम्लांच्या प्रतिस्थापनामुळे ॲराबिडॉप्सिसमध्ये कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्युल रचनांमध्ये तिरकसपणा येतो आणि डाव्या किंवा उजव्या बाजूला वाढ होते 6,7. त्याचप्रमाणे, मायक्रोट्यूब्युलच्या गतिशीलतेचे नियमन करणाऱ्या मायक्रोट्यूब्युल-संबंधित प्रथिनांमधील उत्परिवर्तनामुळे देखील मुळांची वाढ विकृत होऊ शकते 8,9,10,11,12,13. याव्यतिरिक्त, डिसोपायरामाइड, ज्याला प्रेटिलाक्लोर म्हणूनही ओळखले जाते, अशा मायक्रोट्यूब्युल-विघटन करणाऱ्या तणनाशकांच्या उपचारांमुळे देखील मुळांची डाव्या बाजूला तिरकस वाढ होते14. ही माहिती दर्शवते की वनस्पतींच्या वाढीची दिशा निश्चित करण्यासाठी मायक्रोट्यूब्युलच्या कार्याचे अचूक नियमन अत्यंत महत्त्वाचे आहे.
विविध प्रकारचे मायक्रोट्यूब्यूल अवरोधक शोधले गेले आहेत, आणि या औषधांनी सायटोस्केलेटल संशोधनात, तसेच कृषी आणि वैद्यकशास्त्रात महत्त्वपूर्ण योगदान दिले आहे². विशेषतः, ओरिझालिन, डायनायट्रोॲनिलीन संयुगे, डिसोपायरामाइड, बेंझामाइड-संबंधित संयुगे आणि त्यांचे ॲनालॉग्स मायक्रोट्यूब्यूलचे कार्य रोखू शकतात आणि त्यामुळे वनस्पतींची वाढ थांबवू शकतात. म्हणून, त्यांचा तणनाशक म्हणून मोठ्या प्रमाणावर वापर केला जातो. तथापि, मायक्रोट्यूब्यूल्स हे वनस्पती आणि प्राणी पेशींचा एक महत्त्वाचा घटक असल्यामुळे, बहुतेक मायक्रोट्यूब्यूल अवरोधक दोन्ही प्रकारच्या पेशींसाठी सायटोटॉक्सिक (पेशीविषारी) असतात. त्यामुळे, तणनाशक म्हणून त्यांची उपयुक्तता मान्य असूनही, व्यावहारिक हेतूंसाठी मर्यादित संख्येनेच अँटीमायक्रोट्यूब्यूल एजंट्स वापरले जातात.
स्ट्रेप्टोमायसेस हे स्ट्रेप्टोमायसेस कुळातील एक प्रजाती आहे, ज्यामध्ये एरोबिक, ग्रॅम-पॉझिटिव्ह, तंतुमय जीवाणूंचा समावेश होतो आणि ते विविध प्रकारचे दुय्यम चयापचय पदार्थ (secondary metabolites) तयार करण्याच्या क्षमतेसाठी प्रसिद्ध आहे. त्यामुळे, नवीन जैविक दृष्ट्या सक्रिय नैसर्गिक उत्पादनांच्या सर्वात महत्त्वाच्या स्रोतांपैकी एक म्हणून ते ओळखले जाते. सध्याच्या अभ्यासात, आम्ही कौमामोनामाइड नावाचे एक नवीन संयुग शोधले, जे स्ट्रेप्टोमायसेस वेराएन्सिस MK493-CF1 आणि एस. वेराएन्सिस ISP 5486 मधून वेगळे करण्यात आले. स्पेक्ट्रल विश्लेषण आणि पूर्ण स्पेक्ट्रल विश्लेषणाचा वापर करून, कौमामोनामाइडच्या संरचनेचे वैशिष्ट्यीकरण करण्यात आले आणि त्याचा अद्वितीय एन-अल्कोक्सीपायरोल सांगाडा निश्चित करण्यात आला. अर्स्मोनिक आम्ल, जे अर्स्मोनामाइड आणि त्याच्या व्युत्पन्नांचे एक संश्लेषणात्मक मध्यवर्ती संयुग आहे, ते लोकप्रिय मॉडेल वनस्पती ॲराबिडॉप्सिस थॅलियानाच्या वाढीस आणि अंकुरणास प्रतिबंध करते असे आढळून आले. संरचना-क्रिया संबंध अभ्यासात, आम्हाला असे आढळले की C9 ला अर्सोनिक ॲसिडमध्ये रूपांतरित केलेले एक संयुग, ज्याला अर्सोनिक ॲसिडचे नॉनिलॉक्सी डेरिव्हेटिव्ह (KAND) म्हणतात, वाढ आणि अंकुरणावरील प्रतिबंधात्मक प्रभाव लक्षणीयरीत्या वाढवते. विशेष म्हणजे, या नव्याने शोधलेल्या वनस्पती वाढ प्रतिबंधकाने तंबाखू आणि लिव्हरवर्टच्या वाढीवरही परिणाम केला आणि ते जीवाणू किंवा HeLa पेशींसाठी विषारी नव्हते. शिवाय, काही अर्मोटोनिक ॲसिड डेरिव्हेटिव्ह मुळांच्या विकृत स्वरूपाला प्रेरित करतात, ज्यावरून असे सूचित होते की हे डेरिव्हेटिव्ह प्रत्यक्ष किंवा अप्रत्यक्षपणे मायक्रोट्यूब्यूल्सवर परिणाम करतात. या कल्पनेशी सुसंगतपणे, इम्युनोहिस्टोकेमिकली किंवा फ्लोरोसेंट प्रथिनांनी लेबल केलेल्या मायक्रोट्यूब्यूल्सवरील आमच्या निरीक्षणांवरून असे दिसून येते की KAND उपचाराने मायक्रोट्यूब्यूल्सचे विघटन होते. याव्यतिरिक्त, कुमामोटोनिक ॲसिड डेरिव्हेटिव्हच्या उपचाराने ॲक्टिन मायक्रोफिलामेंट्स विस्कळीत झाले. अशाप्रकारे, आम्ही एक नवीन वनस्पती वाढ प्रतिबंधक शोधला आहे, ज्याच्या अद्वितीय कार्यप्रणालीमध्ये सायटोस्केलेटनचा नाश समाविष्ट आहे.
स्ट्रेन MK493-CF1 टोकियोमधील शिनागावा-कु येथील मातीतून वेगळा करण्यात आला. स्ट्रेन MK493-CF1 ने सुशाखित स्ट्रोमल मायसेलियम तयार केले. 16S रायबोसोमल आरएनए जनुकाच्या (1422 bp) आंशिक अनुक्रमाचे निर्धारण करण्यात आले. हा स्ट्रेन S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: टिपिकल स्ट्रेन, 99.93%) शी खूप मिळताजुळता आहे. या परिणामाच्या आधारावर, असे निर्धारित करण्यात आले की हा स्ट्रेन S. werraensis च्या टाइप स्ट्रेनशी जवळचा संबंधित आहे. म्हणून, आम्ही तात्पुरते या स्ट्रेनला S. werraensis MK493-CF1 असे नाव दिले. S. werraensis ISP 5486T देखील तीच जैव-सक्रिय संयुगे तयार करतो. या सूक्ष्मजीवापासून नैसर्गिक उत्पादने मिळवण्यावर सुरुवातीला फारसे संशोधन झाले नसल्यामुळे, पुढील रासायनिक संशोधन करण्यात आले. ३०°C तापमानावर १४ दिवसांसाठी बार्ली माध्यमावर सॉलिड-स्टेट फर्मेंटेशनद्वारे एस. वेराएन्सिस एमके४९३-सीएफ१ (S. werraensis MK493-CF1) चे संवर्धन केल्यानंतर, माध्यमाचे ५०% इथेनॉल (EtOH) वापरून निष्कर्षण करण्यात आले. ६० मिली नमुना वाळवून ५९.५ मिलीग्रॅम अशुद्ध अर्क मिळवण्यात आला. या अशुद्ध अर्कावर रिव्हर्स फेज एचपीएलसी (reverse phase HPLC) प्रक्रिया करून एन-मेथॉक्सी-१एच-पायरोल-२-कार्बोक्सामाइड (१, ज्याला कुमामोनामाइड असे नाव दिले आहे, ३६.० मिलीग्रॅम) मिळवण्यात आले. १ चे एकूण प्रमाण अशुद्ध अर्काच्या अंदाजे ६०% आहे. त्यामुळे, आम्ही कुमामोतोमाइड १ च्या गुणधर्मांचा सविस्तर अभ्यास करण्याचे ठरवले.
कुमामोनामाइड १ ही एक पांढरी अस्फटिकी पावडर आहे आणि उच्च रिझोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HRESIMS) द्वारे C6H8N2O2 असल्याची पुष्टी होते (आकृती १). या संयुगाच्या C2-प्रतिस्थापित पायरोल भागाचे वैशिष्ट्य δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, 1H NMR स्पेक्ट्रममधील δH: 4.5 Hz, H-5) आणि δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) हे आहे, आणि 13C NMR स्पेक्ट्रममध्ये चार sp2 कार्बन अणूंची उपस्थिती दिसून येते. C-3 प्रोटॉनपासून δC 161.1 येथील अमाइड कार्बोनिल कार्बनपर्यंतच्या HMBC सहसंबंधाद्वारे C2 स्थानावर अमाइड गटाच्या उपस्थितीचे मूल्यांकन करण्यात आले. याव्यतिरिक्त, δH 4.10 (3H, S) आणि δC 68.3 येथील 1H आणि 13C NMR शिखरे रेणूमध्ये N-मेथॉक्सी गटांची उपस्थिती दर्शवतात. जरी एन्हांस्ड डिफरन्स स्पेक्ट्रोस्कोपी आणि न्यूक्लियर ओव्हरहाउझर ॲब्रिव्हिएशन (NOEDF) यांसारख्या स्पेक्ट्रोस्कोपिक विश्लेषणाचा वापर करून मेथॉक्सी गटाचे अचूक स्थान अद्याप निश्चित केले गेले नव्हते, तरी N-मेथॉक्सी-1H-पायरोल-2-कार्बोक्सामाइड हे पहिले संभाव्य संयुग ठरले.
१ ची अचूक रचना निश्चित करण्यासाठी, एक संपूर्ण संश्लेषण केले गेले (आकृती २अ). व्यावसायिकरित्या उपलब्ध २-अमिनोपायरीडीन २ वर एम-सीपीबीए (m-CPBA) सह प्रक्रिया केल्याने संबंधित एन-ऑक्साइड ३ परिमाणात्मक उत्पन्नामध्ये प्राप्त झाले. २ च्या २-अमिनोअझिडेशननंतर, अब्रामोविच यांनी वर्णन केलेली सायक्लोकंडेन्सेशन अभिक्रिया बेंझिनमध्ये ९०°C तापमानावर पार पाडून इच्छित १-हायड्रॉक्सी-१एच-पायरोल-२-कार्बोनायट्राइल ५ ग्रॅममध्ये मिळवले. उत्पादन दर ६०% (दोन टप्पे). १५,१६. त्यानंतर ४ चे मिथायलेशन आणि हायड्रोलिसिस केल्याने १-मेथॉक्सी-१एच-पायरोल-२-कार्बोक्सिलिक आम्ल (ज्याला "क्युमोटोनिक आम्ल" म्हणतात, ६) चांगल्या उत्पन्नामध्ये (७०%, दोन टप्पे) प्राप्त झाले. शेवटी, जलीय अमोनिया वापरून आम्ल क्लोराईड मध्यस्थ ६ द्वारे अमायडेशन केल्याने कुमामोटो अमाइड १ ९८% उत्पन्नामध्ये प्राप्त झाले. संश्लेषित 1 चा सर्व स्पेक्ट्रल डेटा विलग केलेल्या 1 शी समान होता, म्हणून 1 ची रचना निश्चित करण्यात आली;
अर्बेनामाइड आणि अर्बेनिक ॲसिडच्या जैविक क्रियाशीलतेचे सामान्य संश्लेषण आणि विश्लेषण. (अ) कुमामोतो अमाइडचे संपूर्ण संश्लेषण. (ब) सात दिवसांच्या वाइल्ड-टाइप ॲराबिडॉप्सिस कोलंबिया (Col) रोपांना, दर्शविलेल्या सांद्रतेमध्ये कौमामोनामाइड ६ किंवा कौमामोनामाइड १ असलेल्या मुराशीगे आणि स्कूग (MS) प्लेट्सवर वाढवण्यात आले. स्केल बार = १ सेमी.
सर्वप्रथम, आम्ही वनस्पतींच्या वाढीवर नियंत्रण ठेवण्याच्या क्षमतेसाठी अर्बेनामाइड आणि त्याच्या मध्यवर्ती संयुगांच्या जैविक क्रियांचे मूल्यांकन केले. आम्ही एमएस अगर माध्यमात अर्स्मोनामाइड १ किंवा अर्स्मोनिक ॲसिड ६ चे विविध सांद्रता मिसळल्या आणि या माध्यमावर ॲराबिडॉप्सिस थॅलियाना रोपांची वाढ केली. या चाचण्यांमधून असे दिसून आले की ६ च्या उच्च सांद्रतेने (५०० μM) मुळांची वाढ रोखली (आकृती २ब). पुढे, आम्ही ६ च्या N1 स्थानी प्रतिस्थापन करून विविध व्युत्पन्न संयुगे तयार केली आणि त्यांच्यावर संरचना-क्रिया संबंधांचा अभ्यास केला (ॲनालॉग संश्लेषण प्रक्रिया सहाय्यक माहितीमध्ये (SI) वर्णन केली आहे). चित्रात दाखवल्याप्रमाणे, ॲराबिडॉप्सिसची रोपे ५० μM अर्सोनिक ॲसिड व्युत्पन्न संयुगे असलेल्या माध्यमावर वाढवण्यात आली आणि मुळांची लांबी मोजण्यात आली. आकृती 3a, b, आणि S1 मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, कुमामो ॲसिडमध्ये N1 स्थितीवर वेगवेगळ्या लांबीच्या रेखीय अल्कोक्सी साखळ्या (9, 10, 11, 12, आणि 13) किंवा मोठ्या अल्कोक्सी साखळ्या (15, 16, आणि 17) असतात. या डेरिव्हेटिव्हजनी मुळांच्या वाढीवर लक्षणीय प्रतिबंध दर्शवला. याव्यतिरिक्त, आम्हाला आढळले की 200 μM 10, 11, किंवा 17 चा वापर केल्याने अंकुरण प्रतिबंधित झाले (आकृती 3c आणि S2).
कुमामोतो अमाइड आणि संबंधित संयुगांच्या संरचना-कार्य संबंधाचा अभ्यास. (अ) समधर्मी संयुगांची संरचना आणि संश्लेषण योजना. (ब) ५० μM कुमामोनामाइड व्युत्पन्नकांसह किंवा त्याशिवाय MS माध्यमावर वाढवलेल्या ७-दिवसांच्या रोपांच्या मुळांच्या लांबीचे परिमाणीकरण. तारकाचिन्हे शाम उपचारासह लक्षणीय फरक दर्शवतात (टी चाचणी, p < 0.05).< 0.05). n>१८. डेटा सरासरी ± प्रमाण विचलन (SD) म्हणून दर्शविला आहे. nt म्हणजे “चाचणी केली नाही” कारण ५०% पेक्षा जास्त बिया रुजल्या नाहीत. (c) २०० μM कौमामोनमाइड आणि संबंधित संयुगांसह किंवा त्याशिवाय MS माध्यमात ७ दिवस उबवलेल्या उपचारित बियांच्या उगवण दराचे परिमाणीकरण. तारकाचिन्हे बनावट उपचारांपेक्षा लक्षणीय फरक दर्शवतात (काय-स्क्वेअर चाचणी). n=९६.
मनोरंजक म्हणजे, C9 पेक्षा लांब अल्काइल साइड चेन जोडल्याने प्रतिबंधात्मक क्रिया कमी झाली, यावरून असे सूचित होते की कुमामोटोइक ऍसिड-संबंधित संयुगांना त्यांची जैविक क्रिया दर्शविण्यासाठी विशिष्ट आकाराच्या साइड चेनची आवश्यकता असते.
संरचना-क्रिया संबंध विश्लेषणातून असे दिसून आले की C9 चे रूपांतर अर्सोनीक आम्लामध्ये झाले आणि अर्सोनीक आम्लाचे नॉनिलॉक्सी व्युत्पन्न (यापुढे KAND 11 म्हणून ओळखले जाईल) हे वनस्पती वाढीस प्रतिबंध करणारे सर्वात प्रभावी घटक होते, म्हणून आम्ही KAND 11 चे अधिक तपशीलवार वैशिष्ट्यीकरण केले. 50 μM KAND 11 ने ॲराबिडॉप्सिसवर उपचार केल्याने अंकुरण जवळजवळ पूर्णपणे थांबले, तर KAND 11 च्या कमी सांद्रतेने (40, 30, 20, किंवा 10 μM) मात्रेनुसार मुळांची वाढ रोखली (आकृती 4a, b). KAND 11 मुळे मूळ मेरिस्टेमच्या व्यवहार्यतेवर परिणाम होतो की नाही हे तपासण्यासाठी, आम्ही प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) ने रंगवलेल्या मूळ मेरिस्टेमची तपासणी केली आणि मेरिस्टेमच्या क्षेत्रफळाचे मोजमाप केले. 25 μM KAND-11 असलेल्या माध्यमावर वाढलेल्या रोपांच्या मेरिस्टेमचा आकार 151.1 ± 32.5 μm होता, तर DMSO असलेल्या नियंत्रण माध्यमावर वाढलेल्या रोपांच्या मेरिस्टेमचा आकार 264.7 ± 30.8 μm होता (आकृती 4c, d), जे दर्शवते की KAND-11 पेशीय क्रियाशीलता पुनर्संचयित करते. मूळ मेरिस्टेम. याच्याशी सुसंगत, KAND 11 उपचाराने मूळ मेरिस्टेममधील पेशी विभाजन मार्कर CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS सिग्नलचे प्रमाण कमी केले (आकृती 4e) 17. हे परिणाम दर्शवतात की KAND 11 पेशींच्या प्रसाराची क्रियाशीलता कमी करून मुळांच्या वाढीस प्रतिबंध करते.
अर्बेनोनिक ॲसिड डेरिव्हेटिव्ह्ज (अर्बेनीलॉक्सी डेरिव्हेटिव्ह्ज) च्या वाढीवरील प्रतिबंधात्मक परिणामाचे विश्लेषण. (अ) KAND 11 च्या दर्शविलेल्या सांद्रतेसह MS प्लेट्सवर वाढवलेली ७-दिवसांची वाइल्ड-टाइप Col रोपे. स्केल बार = १ सेमी. (ब) मुळांच्या लांबीचे परिमाणीकरण. अक्षरे लक्षणीय फरक दर्शवतात (टुकी HSD चाचणी, p < 0.05).< 0.05). n>१६. डेटा सरासरी ± SD म्हणून दर्शविला आहे. (c) २५ μM KAND 11 सह किंवा त्याशिवाय MS प्लेट्सवर वाढवलेल्या प्रोपिडियम आयोडाइड-रंगीत वाइल्ड-टाइप Col मुळांचे कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपी. पांढरे कंस मूळ मेरिस्टेम दर्शवतात. स्केल बार = १०० µm. (d) मूळ मेरिस्टेमच्या आकाराचे परिमाणीकरण (n = १० ते ११). सांख्यिकीय फरक टी-टेस्ट वापरून निर्धारित केले गेले (p < 0.05).< 0.05). बार सरासरी मेरिस्टेम आकार दर्शवतात. (e) CDKB2 कन्स्ट्रक्ट असलेल्या मूळ मेरिस्टेमचे डिफरेंशियल इंटरफेरन्स कॉन्ट्रास्ट (DIC) मायक्रोस्कोपी; 1pro: CDKB2; 1-GUS ने रंगवलेले आणि 25 µM KAND चाचणीसह किंवा त्याशिवाय MS प्लेट्सवर वाढवलेल्या 5-दिवसांच्या रोपांवर रंगवलेले.
KAND 11 ची वनस्पती-विषारीता (phytotoxicity) पुढे तंबाखू (Nicotiana tabacum) या दुसऱ्या द्विदलीय वनस्पतीवर आणि लिव्हरवर्ट (Marchantia polymorpha) या प्रमुख भू-वनस्पती मॉडेल जीवावर तपासण्यात आली. ॲराबिडॉप्सिसप्रमाणेच, 25 μM KAND 11 असलेल्या माध्यमावर वाढवलेल्या तंबाखूच्या SR-1 रोपांची मुळे लहान झाली (आकृती 5a). याव्यतिरिक्त, 200 μM KAND 11 असलेल्या प्लेट्सवर 48 पैकी 40 बिया रुजल्या, तर कोणत्याही उपचारांशिवाय असलेल्या माध्यमावर सर्व 48 बिया रुजल्या, यावरून असे दिसून येते की KAND ची उच्च सांद्रता लक्षणीय होती (p < 0.001).< ०.०५; ची स्क्वेअर चाचणी) ने तंबाखूच्या उगवणीस प्रतिबंध केला. (आकृती ५ब). याव्यतिरिक्त, लिव्हरवर्टमधील जिवाणूंची वाढ रोखणारी KAND 11 ची सांद्रता ॲराबिडॉप्सिसमधील प्रभावी सांद्रतेसारखीच होती (आकृती ५क). हे परिणाम दर्शवतात की KAND 11 विविध प्रकारच्या वनस्पतींची वाढ रोखू शकते. त्यानंतर आम्ही उच्च प्राणी आणि जिवाणू पेशींचे अनुक्रमे प्रतिनिधी म्हणून मानवी HeLa पेशी आणि एशेरिकिया कोलाय स्ट्रेन DH5α या इतर जीवांमध्ये अस्वल मोनोअमाइड-संबंधित संयुगांच्या संभाव्य पेशीविषारीतेचा अभ्यास केला. पेशी प्रसरण चाचण्यांच्या मालिकेत, आम्ही पाहिले की कौमामोनामाइड १, कौमामोनामाइडिक ॲसिड ६, आणि KAND 11 यांनी १०० μM सांद्रतेवर HeLa किंवा E. coli पेशींच्या वाढीवर कोणताही परिणाम केला नाही (आकृती ५ड,इ).
नॉन-ॲराबिडॉप्सिस जीवांमध्ये KAND 11 द्वारे वाढीस प्रतिबंध. (अ) दोन आठवड्यांची वाइल्ड-टाइप SR-1 तंबाखूची रोपे 25 μM KAND 11 असलेल्या उभ्या ठेवलेल्या MS प्लेट्सवर वाढवण्यात आली. (ब) दोन आठवड्यांची वाइल्ड-टाइप SR-1 तंबाखूची रोपे 200 μM KAND 11 असलेल्या आडव्या ठेवलेल्या MS प्लेट्सवर वाढवण्यात आली. (क) KAND 11 च्या दर्शविलेल्या सांद्रतेसह गॅम्बॉर्ग B5 प्लेट्सवर वाढवलेल्या दोन आठवड्यांच्या वाइल्ड-टाइप Tak-1 लिव्हरवर्टच्या कळ्या. लाल बाण दोन आठवड्यांच्या इनक्युबेशन कालावधीत वाढ थांबलेल्या बीजाणूंना दर्शवतात. (ड) HeLa पेशींची पेशी प्रसरण चाचणी. सेल काउंटिंग किट 8 (डोजिंडो) वापरून ठराविक वेळेच्या अंतराने जिवंत पेशींची संख्या मोजण्यात आली. नियंत्रणासाठी, HeLa पेशींना 5 μg/ml ॲक्टिनोमायसिन डी (ॲक्ट डी) देण्यात आले, जे RNA पॉलिमरेज ट्रान्सक्रिप्शनला प्रतिबंधित करते आणि पेशींचा मृत्यू घडवते. विश्लेषणे तीन वेळा करण्यात आली. (इ) ई. कोलाय पेशी प्रसरण चाचणी. OD600 मोजून ई. कोलायच्या वाढीचे विश्लेषण करण्यात आले. नियंत्रक म्हणून, पेशींना ५० μg/ml ॲम्पीसिलिन (Amp) देण्यात आले, जे जिवाणूंच्या पेशीभित्तिकेच्या संश्लेषणास प्रतिबंध करते. विश्लेषणे तीन वेळा करण्यात आली.
युरॅमाइड-संबंधित संयुगांमुळे होणाऱ्या सायटोटॉक्सिसिटीच्या कार्यप्रणालीचे आकलन करण्यासाठी, आम्ही मध्यम प्रतिबंधात्मक प्रभाव असलेल्या अर्बेनिक ॲसिड डेरिव्हेटिव्ह्जचे पुनर्वविश्लेषण केले, जसे चित्रात दाखवले आहे. आकृती २ब, ६अ मध्ये दाखवल्याप्रमाणे, अर्मोटोनिक ॲसिड ६ च्या उच्च सांद्रता (२०० μM) असलेल्या अगर प्लेट्सवर वाढलेल्या रोपांना लहान आणि डावीकडे वळलेली मुळे (θ = – २३.७ ± ६.१) आली, तर नियंत्रण माध्यमावर वाढलेल्या रोपांना जवळजवळ सरळ मुळे (θ = – ३.८ ± ७.१) आली. ही वैशिष्ट्यपूर्ण तिरकस वाढ कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्सच्या बिघाडामुळे होते हे ज्ञात आहे¹⁴,¹⁸. या निष्कर्षाशी सुसंगतपणे, मायक्रोट्यूब्यूल-अस्थिर करणारी औषधे डिसोपायरामाइड आणि ओरिझालिन यांनी आमच्या वाढीच्या परिस्थितीत मुळांना असाच तिरकेपणा आणला (आकृती २ब, ६अ). त्याच वेळी, आम्ही अर्मोटोनिक ॲसिड डेरिव्हेटिव्ह्जची चाचणी केली आणि त्यापैकी काही निवडले जे, विशिष्ट सांद्रतेवर, मुळांची तिरकस वाढ घडवून आणतात. संयुगे ८, ९, आणि १५ यांनी अनुक्रमे ७५ μM, ५० μM, आणि ४० μM सांद्रतेवर मुळांच्या वाढीची दिशा बदलली, जे दर्शवते की ही संयुगे मायक्रोट्यूब्यूल्सना प्रभावीपणे अस्थिर करू शकतात (आकृती २ब, ६अ). आम्ही सर्वात प्रभावी अर्सोलिक ॲसिड डेरिव्हेटिव्ह, KAND 11, ची कमी सांद्रतेवर (१५ µM) देखील चाचणी केली आणि आम्हाला आढळले की KAND 11 च्या वापरामुळे मुळांची वाढ खुंटली आणि मुळांच्या वाढीची दिशा असमान होती, जरी त्यांचा कल डावीकडे झुकलेला होता (आकृती C3). कारण मायक्रोट्यूब्यूल-अस्थिर करणाऱ्या औषधांची उच्च सांद्रता कधीकधी मुळे तिरकी करण्याऐवजी वनस्पतींची वाढ खुंटवते, म्हणून आम्ही नंतर मुळांच्या बाह्यत्वचा पेशींमधील कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्सचे निरीक्षण करून KAND 11 मायक्रोट्यूब्यूल्सवर परिणाम करते का, या शक्यतेचे मूल्यांकन केले. २५ μM KAND 11 ने उपचारित केलेल्या रोपांच्या मुळांच्या बाह्यत्वचा पेशींमध्ये अँटी-β-ट्युबुलिन अँटीबॉडीज वापरून केलेल्या इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्रीमध्ये, लांबी वाढवणाऱ्या भागातील बाह्यत्वचा पेशींमधील जवळजवळ सर्व कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्स नाहीसे झाल्याचे दिसून आले (आकृती ६ब). या परिणामांवरून असे सूचित होते की, कुमामोटोनिक ॲसिड आणि त्याचे व्युत्पन्न पदार्थ मायक्रोट्यूब्यूल्सना विस्कळीत करण्यासाठी त्यांच्यावर प्रत्यक्ष किंवा अप्रत्यक्षपणे कार्य करतात आणि ही संयुगे नवीन मायक्रोट्यूब्यूल अवरोधक आहेत.
अर्सोनीक आम्ल आणि त्याचे व्युत्पन्न पदार्थ ॲराबिडॉप्सिस थॅलियानामध्ये कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्समध्ये बदल घडवतात. (अ) दर्शविलेल्या सांद्रतेमध्ये विविध अर्मोटोनिक आम्ल व्युत्पन्न पदार्थांच्या उपस्थितीत मोजलेला मुळाचा झुकण्याचा कोन. मायक्रोट्यूब्यूल्सना अवरोधित करण्यासाठी ओळखल्या जाणाऱ्या दोन संयुगांचे: डिसोपायरामाइड आणि ओरिझालिन यांचे परिणाम देखील विश्लेषित केले गेले. लहान आकृतीमध्ये मुळाच्या वाढीचा कोन मोजण्यासाठी वापरलेले मानक दाखवले आहे. तारकाचिन्हे बनावट उपचारांपेक्षा लक्षणीय फरक दर्शवतात (टी चाचणी, पी < ०.००१).< 0.05). n>१९. स्केल बार = १ सेमी. (ब) एलॉन्गेशन झोनमधील एपिडर्मल पेशींमधील कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्स. २५ μM KAND 11 सह किंवा त्याशिवाय MS प्लेट्सवर वाढवलेल्या वाइल्ड-टाइप अ‍ॅरेबिडोप्सिस कोलच्या मुळांमधील मायक्रोट्यूब्यूल्स, β-ट्युबुलिन प्रायमरी अँटीबॉडीज आणि अलेक्सा फ्लोअर-कॉन्जुगेटेड सेकंडरी अँटीबॉडीज वापरून इम्युनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंगद्वारे दृश्यमान करण्यात आले. स्केल बार = १० µm. (क) रूट मेरिस्टेममधील मायक्रोट्यूब्यूल्सची मायटोटिक रचना. इम्युनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग वापरून मायक्रोट्यूब्यूल्स दृश्यमान करण्यात आले. प्रोफेज झोन, स्पिंडल्स आणि फ्रॅग्मोप्लास्ट्ससह मायटोटिक रचनांची गणना कॉन्फोकल इमेजेसवरून करण्यात आली. बाण मायटोटिक मायक्रोट्यूब्यूल रचना दर्शवतात. तारकाचिन्हे शॅम ट्रीटमेंटमधील लक्षणीय फरक दर्शवतात (टी टेस्ट, p < 0.05).< 0.05). n>९. मापपट्टी = ५० µm.
जरी उर्सा (Ursa) मध्ये मायक्रोट्यूब्यूलचे कार्य विस्कळीत करण्याची क्षमता असली तरी, त्याच्या कार्यपद्धतीची पद्धत सामान्य मायक्रोट्यूब्यूल डीपॉलिमरायझिंग एजंट्सपेक्षा वेगळी असण्याची अपेक्षा आहे. उदाहरणार्थ, डिसोपायरामाइड आणि ओरिझालिन सारख्या मायक्रोट्यूब्यूल डीपॉलिमरायझिंग एजंट्सची उच्च सांद्रता एपिडर्मल पेशींचा अनिसोट्रॉपिक विस्तार घडवून आणते, तर KAND 11 तसे करत नाही. याव्यतिरिक्त, KAND 11 आणि डिसोपायरामाइडच्या एकत्रित वापरामुळे डिसोपायरामाइड-प्रेरित मुळांच्या वाढीचा एकत्रित प्रतिसाद आणि KAND 11-प्रेरित वाढीतील प्रतिबंध दिसून आला (आकृती S4). आम्ही हायपरसेन्सिटिव्ह डिसोपायरामाइड 1-1 (phs1-1) म्युटंटच्या KAND 11 ला दिलेल्या प्रतिसादाचे देखील विश्लेषण केले. phs1-1 मध्ये एक नॉन-कॅनोनिकल ट्युब्युलिन कायनेज पॉइंट म्युटेशन आहे आणि डिसोपायरामाइडने उपचार केल्यावर त्याची मुळे लहान होतात9,20. KAND 11 असलेल्या अगर माध्यमावर वाढवलेल्या phs1-1 म्युटंट रोपांची मुळे डिसोपायरामाइडवर वाढवलेल्या रोपांप्रमाणेच लहान होती (आकृती S5).
याव्यतिरिक्त, KAND 11 ने उपचारित केलेल्या रोपांच्या मूळ मेरिस्टेममध्ये आम्हाला प्रोफेज झोन, स्पिंडल आणि फ्रॅग्मोप्लास्ट यांसारख्या मायटोटिक मायक्रोट्यूब्यूल संरचना आढळल्या. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS साठी केलेल्या निरीक्षणांशी सुसंगतपणे, मायटोटिक मायक्रोट्यूब्यूल्सच्या संख्येत लक्षणीय घट दिसून आली (आकृती .6c).
उपपेशीय स्तरावर KAND 11 च्या पेशीविषारीतेचे वैशिष्ट्य ठरवण्यासाठी, आम्ही तंबाखूच्या BY-2 निलंबन पेशींवर KAND 11 ने उपचार केले आणि त्यांच्या प्रतिसादाचे निरीक्षण केले. कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्सवरील KAND 11 चा परिणाम तपासण्यासाठी, आम्ही प्रथम TagRFP-TUA6 व्यक्त करणाऱ्या BY-2 पेशींमध्ये KAND 11 टाकले, जे मायक्रोट्यूब्यूल्सना प्रतिदीप्तपणे लेबल करते. कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल घनतेचे मूल्यांकन प्रतिमा विश्लेषणाचा वापर करून केले गेले, ज्यामध्ये सायटोप्लाज्मिक पिक्सेल्समधील सायटोस्केलेटल पिक्सेल्सची टक्केवारी मोजली गेली. चाचणीच्या निकालांवरून असे दिसून आले की, 50 μM किंवा 100 μM KAND 11 ने 1 तास उपचार केल्यानंतर, घनता अनुक्रमे 0.94 ± 0.74% किंवा 0.23 ± 0.28% पर्यंत लक्षणीयरीत्या कमी झाली, तर DMSO ने उपचार केलेल्या पेशींची घनता 1.61 ± 0.34% होती (आकृती 7a). हे परिणाम अ‍ॅरेबिडॉप्सिसमधील निरीक्षणाशी सुसंगत आहेत की KAND 11 उपचारामुळे कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्सचे डीपॉलिमरायझेशन होते (आकृती 6b). आम्ही KAND 11 च्या त्याच सांद्रतेने उपचार केल्यानंतर GFP-ABD-लेबल केलेल्या अ‍ॅक्टिन फिलामेंट्ससह BY-2 लाइनची देखील तपासणी केली आणि असे निरीक्षण केले की KAND 11 उपचाराने अ‍ॅक्टिन फिलामेंट्स विस्कळीत झाले. 1 तासासाठी 50 μM किंवा 100 μM KAND 11 ने उपचार केल्याने अ‍ॅक्टिन फिलामेंटची घनता अनुक्रमे 1.20 ± 0.62% किंवा 0.61 ± 0.26% पर्यंत लक्षणीयरीत्या कमी झाली, तर DMSO-उपचारित पेशींमध्ये ही घनता 1.69 ± 0.51% होती (आकृती 2. 7b). हे परिणाम प्रोपायझामाइडच्या परिणामांच्या विरुद्ध आहेत, जे अ‍ॅक्टिन फिलामेंट्सवर परिणाम करत नाही, आणि लॅट्रनक्युलिन बी, एक अ‍ॅक्टिन डीपॉलिमरायझर जे मायक्रोट्यूब्यूल्सवर परिणाम करत नाही (SI आकृती S6). याव्यतिरिक्त, कौमामोनामाइड 1, कौमामोनामाइड ॲसिड 6, किंवा KAND 11 ने केलेल्या उपचारांचा HeLa पेशींमधील मायक्रोट्यूब्यूल्सवर परिणाम झाला नाही (SI आकृती S7). त्यामुळे, KAND 11 ची कार्यपद्धती ज्ञात सायटोस्केलेटन विस्कळीत करणाऱ्यांपेक्षा वेगळी असल्याचे मानले जाते. याव्यतिरिक्त, KAND 11 ने उपचार केलेल्या BY-2 पेशींच्या आमच्या सूक्ष्मदर्शकीय निरीक्षणातून असे दिसून आले की KAND 11 उपचारादरम्यान पेशी मृत्यूची सुरुवात झाली आणि KAND 11 उपचाराच्या 30 मिनिटांनंतर इव्हान्स ब्लूने रंगवलेल्या मृत पेशींचे प्रमाण लक्षणीयरीत्या वाढले नाही, तर 50 μM किंवा 100 μM KAND च्या 90 मिनिटांच्या उपचारानंतर मृत पेशींची संख्या अनुक्रमे 43.7% किंवा 80.1% पर्यंत वाढली (आकृती 7c). एकंदरीत, ही माहिती दर्शवते की नवीन अर्सोलिक ॲसिड डेरिव्हेटिव्ह KAND 11 हा एक वनस्पती-विशिष्ट सायटोस्केलेटल अवरोधक आहे, ज्याची कार्यपद्धती पूर्वी अज्ञात होती.
KAND तंबाखूच्या BY-2 पेशींमधील कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्स, ॲक्टिन फिलामेंट्स आणि जीवनक्षमतेवर परिणाम करते. (अ) TagRFP-TUA6 च्या उपस्थितीत BY-2 पेशींमधील कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्सचे दृश्यांकन. KAND 11 (50 μM किंवा 100 μM) किंवा DMSO ने उपचार केलेल्या BY-2 पेशींची कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपीद्वारे तपासणी करण्यात आली. 25 स्वतंत्र पेशींच्या मायक्रोग्राफ्सवरून कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल घनतेची गणना करण्यात आली. अक्षरे लक्षणीय फरक दर्शवतात (टुकी HSD चाचणी, p < 0.05).< 0.05). स्केल बार = 10 µm. (b) GFP-ABD2 च्या उपस्थितीत BY-2 पेशींमधील कॉर्टिकल ॲक्टिन फिलामेंट्स दृश्यमान केले. KAND 11 (50 μM किंवा 100 μM) किंवा DMSO ने उपचार केलेल्या BY-2 पेशींची कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपीद्वारे तपासणी करण्यात आली. 25 स्वतंत्र पेशींच्या मायक्रोग्राफ्सवरून कॉर्टिकल ॲक्टिन फिलामेंट्सची घनता मोजण्यात आली. अक्षरे लक्षणीय फरक दर्शवतात (टुकी HSD चाचणी, p < 0.05).< 0.05). स्केल बार = 10 µm. (c) इव्हान्स ब्लू स्टेनिंगद्वारे मृत BY-2 पेशींचे निरीक्षण. KAND 11 (50 μM किंवा 100 μM) किंवा DMSO ने उपचार केलेल्या BY-2 पेशींची ब्राइट-फिल्ड मायक्रोस्कोपीद्वारे तपासणी करण्यात आली. n=3. स्केल बार = 100 µm.
नवीन नैसर्गिक उत्पादनांच्या शोधाने आणि वापरामुळे वैद्यकशास्त्र आणि कृषीसह मानवी जीवनाच्या विविध पैलूंमध्ये महत्त्वपूर्ण प्रगती झाली आहे. नैसर्गिक संसाधनांमधून उपयुक्त संयुगे मिळवण्यासाठी ऐतिहासिक संशोधन केले गेले आहे. विशेषतः, ॲक्टिनोमायसीट्स हे सूत्रकृमींसाठी परजीवीविरोधी प्रतिजैविक म्हणून उपयुक्त असल्याचे ज्ञात आहे, कारण त्यांच्यामध्ये ॲव्हरमेक्टिन (आयव्हरमेक्टिनचे प्रमुख संयुग) आणि ब्लिओमायसिन व त्याची व्युत्पन्नके (जी कर्करोगविरोधी घटक म्हणून औषधीयदृष्ट्या वापरली जातात) यांसारखी विविध दुय्यम चयापचय उत्पादने तयार करण्याची क्षमता असते²¹,²². त्याचप्रमाणे, ॲक्टिनोमायसीट्समधून विविध तणनाशक संयुगे शोधली गेली आहेत, त्यापैकी काही आधीच व्यावसायिकरित्या वापरली जातात¹,²³. म्हणून, इच्छित जैविक क्रियाकलाप असलेली नैसर्गिक उत्पादने वेगळी करण्यासाठी ॲक्टिनोमायसीट चयापचय उत्पादनांचे विश्लेषण करणे ही एक प्रभावी रणनीती मानली जाते. या अभ्यासात, आम्ही एस. वेरेन्सिसमधून कौमामोनामाइड नावाचे एक नवीन संयुग शोधले आणि त्याचे यशस्वीरित्या संश्लेषण केले. अर्सोनीक ॲसिड हे अर्बेनामाइड आणि त्याच्या व्युत्पन्नकांचे एक संश्लेषणात्मक मध्यवर्ती संयुग आहे. त्यामुळे मुळांना वैशिष्ट्यपूर्ण पीळ पडू शकतो, मध्यम ते तीव्र तणनाशक क्रियाशीलता दिसून येते आणि ते प्रत्यक्ष किंवा अप्रत्यक्षपणे वनस्पतींच्या मायक्रोट्यूब्यूल्सना नुकसान पोहोचवते. तथापि, अर्मोटोनिक ॲसिडच्या कार्याची यंत्रणा सध्याच्या मायक्रोट्यूब्यूल अवरोधकांपेक्षा वेगळी असू शकते, कारण KAND 11 ॲक्टिन फिलामेंट्सना देखील विस्कळीत करते आणि पेशींचा मृत्यू घडवून आणते. यावरून असे सूचित होते की, अर्मोटोनिक ॲसिड आणि त्याचे व्युत्पन्न पदार्थ एका अशा नियामक यंत्रणेद्वारे सायटोस्केलेटलच्या विविध संरचनांवर प्रभाव टाकतात.
अर्बेनोनिक ॲसिडच्या अधिक तपशीलवार वैशिष्ट्यीकरणामुळे त्याच्या कार्यप्रणालीची यंत्रणा अधिक चांगल्या प्रकारे समजण्यास मदत होईल. विशेषतः, अर्सेनिक ॲसिड आणि त्याचे व्युत्पन्न थेट मायक्रोट्यूब्यूल्सवर कार्य करून त्यांचे विघटन करतात की त्यांच्या क्रियेमुळे मायक्रोट्यूब्यूल्स अस्थिर होतात, हे ठरवण्यासाठी अर्सेनिक ॲसिडच्या क्षीण झालेल्या मायक्रोट्यूब्यूल्सना बांधण्याच्या क्षमतेचे मूल्यांकन करणे हे पुढील उद्दिष्ट आहे. याव्यतिरिक्त, ज्या बाबतीत मायक्रोट्यूब्यूल्स थेट लक्ष्य नसतात, त्या बाबतीत वनस्पती पेशींवरील अर्सेनिक ॲसिडच्या क्रियेचे स्थान आणि आण्विक लक्ष्ये ओळखल्याने संबंधित संयुगांचे गुणधर्म आणि तणनाशक क्रियाशीलता सुधारण्याचे संभाव्य मार्ग अधिक चांगल्या प्रकारे समजण्यास मदत होईल. आमच्या जैवक्रियाशीलता चाचणीतून असे दिसून आले की अर्सेनिक ॲसिडमध्ये ॲराबिडॉप्सिस थॅलियाना, तंबाखू आणि लिव्हरवर्ट यांसारख्या वनस्पतींच्या वाढीवर एक अद्वितीय पेशीविषारी क्षमता आहे, तर ई. कोलाय किंवा हेला पेशींवर कोणताही परिणाम झाला नाही. जर अर्सेनिक ॲसिडचे व्युत्पन्न खुल्या शेती क्षेत्रांमध्ये वापरण्यासाठी तणनाशक म्हणून विकसित केले गेले, तर प्राणी पेशींसाठी त्यांची कमी किंवा शून्य विषारीता हा एक फायदा आहे. खरं तर, मायक्रोट्यूब्यूल्स या युकेरियोट्समधील सामान्य संरचना असल्याने, वनस्पतींमध्ये त्यांचे निवडक प्रतिबंध हे तणनाशकांसाठी एक प्रमुख आवश्यकता आहे. उदाहरणार्थ, प्रोपिझामाइड, एक मायक्रोट्यूब्यूल डीपॉलिमरायझिंग एजंट जो थेट ट्युब्युलिनला बांधला जातो आणि पॉलिमरायझेशनला प्रतिबंधित करतो, तो प्राणी पेशींसाठी कमी विषारीपणामुळे तणनाशक म्हणून वापरला जातो²⁴. डिसोपिरामाइडच्या विपरीत, संबंधित बेंझामाइड्समध्ये भिन्न लक्ष्य विशिष्टता असते. वनस्पतींच्या मायक्रोट्यूब्यूल्स व्यतिरिक्त, RH-4032 किंवा बेंझोक्सामाइड अनुक्रमे प्राणी पेशी किंवा ऊमायसीट्सच्या मायक्रोट्यूब्यूल्सना देखील प्रतिबंधित करतात, आणि झॅलिलामाइड त्याच्या कमी वनस्पती-विषारीपणामुळे बुरशीनाशक म्हणून वापरला जातो²⁵,²⁶,²⁷. नव्याने शोधलेला बेअर आणि त्याचे व्युत्पन्न वनस्पतींविरुद्ध निवडक सायटोटॉक्सिसिटी दर्शवतात, परंतु हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की पुढील सुधारणांमुळे त्यांची लक्ष्य विशिष्टता बदलू शकते, ज्यामुळे रोगजनक बुरशी किंवा ऊमायसीट्सच्या नियंत्रणासाठी संभाव्यतः अतिरिक्त व्युत्पन्न उपलब्ध होऊ शकतात.
अर्बेनोनिक आम्ल आणि त्याच्या व्युत्पन्नांचे अद्वितीय गुणधर्म तणनाशक म्हणून त्यांच्या विकासासाठी आणि संशोधन साधनांच्या वापरासाठी उपयुक्त आहेत. वनस्पती पेशींचा आकार नियंत्रित करण्यात सायटोस्केलेटनचे महत्त्व सर्वमान्य आहे. पूर्वीच्या अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की, वनस्पतींनी मॉर्फोजेनेसिसवर योग्य नियंत्रण ठेवण्यासाठी मायक्रोट्यूब्यूल डायनॅमिक्सवर नियंत्रण ठेवून कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल संघटनेची गुंतागुंतीची यंत्रणा विकसित केली आहे. मायक्रोट्यूब्यूलच्या कार्याचे नियमन करण्यासाठी जबाबदार असलेल्या मोठ्या संख्येने रेणू ओळखले गेले आहेत आणि संबंधित संशोधन अजूनही चालू आहे3,4,28. वनस्पती पेशींमधील मायक्रोट्यूब्यूल डायनॅमिक्सबद्दलची आपली सध्याची समज कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल संघटनेच्या यंत्रणा पूर्णपणे स्पष्ट करत नाही. उदाहरणार्थ, डिसोपायरामाइड आणि ओरिझालिन दोन्ही मायक्रोट्यूब्यूल्सचे विघटन करू शकत असले तरी, डिसोपायरामाइडमुळे मुळांमध्ये तीव्र विकृती येते, तर ओरिझालिनचा परिणाम तुलनेने सौम्य असतो. शिवाय, मायक्रोट्यूब्यूल्सना स्थिर करणाऱ्या ट्युब्युलिनमधील उत्परिवर्तनामुळे मुळांमध्ये डेक्स्ट्रोरोटेशन (उजव्या दिशेने फिरणे) देखील होते, तर मायक्रोट्यूब्यूल डायनॅमिक्सला स्थिर करणारा पॅक्लिटॅक्सेल तसे करत नाही. त्यामुळे, अर्सोलिक ॲसिडच्या आण्विक लक्ष्यांचा अभ्यास आणि ओळख पटवल्यास वनस्पतींच्या कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्सच्या नियमनाविषयी नवीन अंतर्दृष्टी मिळेल. त्याचप्रमाणे, विकृत वाढीस चालना देण्यासाठी प्रभावी असलेल्या डिसोपायरामाइडसारख्या रसायनांची आणि ओरिझालिन किंवा कुमामोटोरिक ॲसिडसारख्या कमी प्रभावी रसायनांची भविष्यात तुलना केल्यास, विकृत वाढ कशी होते याबद्दल संकेत मिळतील.
दुसरीकडे, अर्सोनिक ॲसिडच्या सायटोटॉक्सिसिटीचे स्पष्टीकरण देण्यासाठी संरक्षण-संबंधित सायटोस्केलेटल पुनर्रचना ही आणखी एक शक्यता आहे. वनस्पती पेशींमध्ये रोगजनकाचा संसर्ग किंवा एलिसिटरचा प्रवेश कधीकधी सायटोस्केलेटनचा नाश आणि त्यानंतर पेशी मृत्यूस कारणीभूत ठरतो²⁹. उदाहरणार्थ, ओओमायसेट-व्युत्पन्न क्रिप्टोकझॅन्थिन तंबाखूच्या पेशींच्या मृत्यूपूर्वी मायक्रोट्यूब्यूल्स आणि ॲक्टिन फिलामेंट्स विस्कळीत करते असे नोंदवले गेले आहे, जे KAND उपचाराने घडणाऱ्या गोष्टींसारखेच आहे³⁰,³¹. अर्सोनिक ॲसिडमुळे प्रेरित संरक्षण प्रतिसाद आणि पेशीय प्रतिसाद यांच्यातील समानतेमुळे आम्ही असा सिद्धांत मांडला की ते समान पेशीय प्रक्रिया सुरू करतात, जरी क्रिप्टोकझॅन्थिनपेक्षा अर्सोनिक ॲसिडचा जलद आणि अधिक तीव्र परिणाम स्पष्ट दिसतो. तथापि, अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की ॲक्टिन फिलामेंट्सचे विघटन स्वयंस्फूर्त पेशी मृत्यूला प्रोत्साहन देते, ज्यासोबत नेहमीच मायक्रोट्यूब्यूल्सचे विघटन होत नाही²⁹. याव्यतिरिक्त, अर्सोनिक ॲसिड डेरिव्हेटिव्हजप्रमाणे रोगजनक किंवा एलिसिटरमुळे मुळांची वाढ विकृत होते की नाही हे पाहणे बाकी आहे. अशाप्रकारे, संरक्षण प्रतिसाद आणि सायटोस्केलेटन यांना जोडणारे आण्विक ज्ञान ही एक आकर्षक समस्या आहे ज्यावर लक्ष केंद्रित करणे आवश्यक आहे. अर्सोनिक आम्लाशी संबंधित कमी रेण्वीय वजनाच्या संयुगांच्या, तसेच विविध क्षमता असलेल्या त्यांच्या व्युत्पन्नांच्या उपस्थितीचा उपयोग करून, ते अज्ञात पेशीय यंत्रणांना लक्ष्य करण्याच्या संधी उपलब्ध करून देऊ शकतात.
एकत्रितपणे पाहता, मायक्रोट्यूब्यूलच्या गतिशीलतेत बदल घडवणाऱ्या नवीन संयुगांचा शोध आणि वापर, वनस्पती पेशींचा आकार निश्चित करण्यामागील गुंतागुंतीच्या आण्विक यंत्रणा समजून घेण्यासाठी प्रभावी पद्धती उपलब्ध करून देईल. या संदर्भात, अलीकडेच विकसित झालेले अर्मोटोनिक ॲसिड हे संयुग, जे मायक्रोट्यूब्यूल्स आणि ॲक्टिन फिलामेंट्सवर परिणाम करते व पेशी मृत्यू घडवून आणते, मायक्रोट्यूब्यूल नियंत्रण आणि या इतर यंत्रणांमधील संबंध उलगडण्याची संधी देऊ शकते. अशाप्रकारे, अर्बेनोनिक ॲसिडचा वापर करून केलेले रासायनिक आणि जैविक विश्लेषण, वनस्पतींच्या सायटोस्केलेटनला नियंत्रित करणाऱ्या आण्विक नियामक यंत्रणा समजून घेण्यास आपल्याला मदत करेल.
५०० मिलीलीटरच्या बॅफल्ड एर्लेनमेयर फ्लास्कमध्ये ११० मिलीलीटर सीड मीडियम घेऊन त्यात एस. वेराएन्सिस एमके४९३-सीएफ१ (S. werraensis MK493-CF1) चे इनॉक्युलेशन करा. या सीड मीडियममध्ये २% (वजन/आकारमान) गॅलॅक्टोज, २% (वजन/आकारमान) इसेन्स पेस्ट, १% (वजन/आकारमान) बॅक्टो-सोयाटोन (थर्मो फिशर सायंटिफिक, इंक.), ०.५% (वजन/आकारमान) कॉर्न एक्सट्रॅक्ट (कोगोस्टच कं., लि., जपान), ०.२% (वजन/आकारमान) (NH4)2SO4 आणि ०.२% CaCO3 हे डीआयनाइज्ड वॉटरमध्ये (निर्जलित पाण्यात) मिसळलेले असते. (निर्जंतुकीकरणापूर्वी पीएच ७.४). सीड कल्चर्सना २७°C तापमानावर २ दिवसांसाठी रोटरी शेकरवर (१८० आरपीएम) इनक्युबेट करण्यात आले. सॉलिड स्टेट फर्मेंटेशनद्वारे उत्पादन संवर्धन. सीड कल्चर (७ मिली) एका ५०० मिलीच्या K-1 फ्लास्कमध्ये हस्तांतरित करण्यात आले, ज्यामध्ये ४० ग्रॅम उत्पादन माध्यम होते. या उत्पादन माध्यमात १५ ग्रॅम दाबलेली बार्ली (MUSO Co., Ltd., जपान) आणि २५ ग्रॅम डीआयनाइज्ड पाणी (निर्जंतुकीकरणापूर्वी pH समायोजित न केलेले) यांचा समावेश होता. किण्वन प्रक्रिया ३०°C तापमानावर अंधारात १४ दिवसांसाठी पार पाडण्यात आली. किण्वन सामग्री ४० मिली/बाटली EtOH वापरून एक्सट्रॅक्ट करण्यात आली आणि सेंट्रीफ्यूज करण्यात आली (१५०० ग्रॅम, ४°C, १० मिनिटे). कल्चर सुपरनॅटंट (६० मिली) १०% MeOH/EtOAc च्या मिश्रणाने एक्सट्रॅक्ट करण्यात आले. सेंद्रिय थर कमी दाबाखाली बाष्पीभवन करून अवशेष (59.5 मिग्रॅ) मिळवण्यात आला, ज्यावर रिव्हर्स फेज कॉलम (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × लांबी 250 mm) वर 1.5 मि.ली./मिनिटच्या प्रवाह दराने ग्रेडियंट इल्युशन (0–10 मिनिटे: 90%) सह HPLC केले असता, कौमामोनामाइड (1, 36.0 मिग्रॅ) पांढऱ्या अस्फटिक पावडरच्या स्वरूपात वेगळे करण्यात आले.
कुमामोटोअमाइड(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ गणना केलेले मूल्य: 141.0659, मोजलेले मूल्य: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
कोलंबिया बियाणे (Col-0) संशोधनासाठी वापरण्याच्या परवानगीने अ‍ॅरेबिडॉप्सिस बायोलॉजिकल रिसोर्स सेंटर (ABRC) कडून मिळवण्यात आले. Col-0 बियाण्यांची आमच्या प्रयोगशाळेतील परिस्थितीत वाढ व देखभाल करण्यात आली आणि त्यांचा वापर वाइल्ड-टाइप अ‍ॅरेबिडॉप्सिस वनस्पती म्हणून करण्यात आला. अ‍ॅरेबिडॉप्सिस बियाण्यांना पृष्ठभागावर निर्जंतुक करून, २% सुक्रोज (फुजीफिल्म वाको प्युअर केमिकल), ०.०५% (w/v) २-(४-मॉर्फोलिनो)इथेनसल्फॉनिक ॲसिड (MES) (फुजीफिल्म वाको प्युअर केमिकल) आणि १.५% आगर (फुजीफिल्म वाको प्युअर केमिकल) असलेल्या अर्ध्या-शक्तीच्या मुराशीगे आणि स्कूग माध्यमात, pH ५.७, २३ °C तापमानात आणि सतत प्रकाशात संवर्धित करण्यात आले. phs1-1 म्युटंटची बियाणे टी. हाशिमोटो (नारा इन्स्टिट्यूट ऑफ सायन्स अँड टेक्नॉलॉजी) यांनी पुरवली होती.
एसआर-१ (SR-1) जातीच्या बिया टी. हाशिमोटो (नारा इन्स्टिट्यूट ऑफ सायन्स अँड टेक्नॉलॉजी) यांनी पुरवल्या होत्या आणि त्यांचा वापर वन्य प्रकारच्या तंबाखूच्या रोपांप्रमाणे करण्यात आला. तंबाखूच्या बिया पृष्ठभागावरून निर्जंतुक करून उगवण होण्यासाठी तीन रात्री निर्जंतुक पाण्यात भिजवून ठेवण्यात आल्या, त्यानंतर त्या २% सुक्रोज, ०.०५% (वजन/आकारमान) एमईएस (MES), आणि ०.८% गेलन गम (फुजीफिल्म वाको प्युअर केमिकल) असलेल्या अर्ध-तीव्रतेच्या द्रावणात (मुराशीगे आणि स्कूग माध्यम) पीएच ५.७ सह ठेवण्यात आल्या आणि २३°C तापमानावर सतत प्रकाशात उबवण्यात आल्या.
स्ट्रेन टाक-१ (Tak-1) टी. कोहची (क्योटो विद्यापीठ) यांनी पुरवला होता आणि लिव्हरवर्टच्या अभ्यासासाठी मानक प्रायोगिक एकक म्हणून त्याचा वापर करण्यात आला. निर्जंतुक केलेल्या संवर्धित वनस्पतींपासून जेमा मिळवण्यात आला आणि नंतर १% सुक्रोज व ०.३% गेलन गम असलेल्या गॅम्बॉर्ग बी५ (Gamborg B5) माध्यमावर (फुजीफिल्म वाको प्युअर केमिकल) तो पसरवण्यात आला व २३°C तापमानावर सतत प्रकाशात उबवण्यात आला.
तंबाखूच्या BY-2 पेशी (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) एस. हासेझावा (टोकियो विद्यापीठ) यांनी पुरवल्या होत्या. BY-2 पेशी सुधारित लिन्समेयर आणि स्कुग माध्यमात ९५ पट विरळ केल्या गेल्या आणि त्यात दर आठवड्याला २,४-डायक्लोरोफेनॉक्सीएसेटिक ॲसिड ३२ पूरक म्हणून दिले गेले. पेशींचे निलंबन अंधारात २७°C तापमानावर रोटरी शेकरवर १३० rpm वेगाने मिसळले गेले. पेशींना ताज्या माध्यमाच्या १० पट आकारमानाने धुवा आणि त्याच माध्यमात पुन्हा निलंबित करा. कॉलीफ्लॉवर मोझॅक व्हायरस 35S प्रमोटरखाली मायक्रोट्यूब्यूल मार्कर TagRFP-TUA6 किंवा ॲक्टिन फिलामेंट मार्कर GFP-ABD2 स्थिरपणे व्यक्त करणाऱ्या BY-2 ट्रान्सजेनिक पेशी रेषा वर्णन केल्याप्रमाणे ३३,३४,३५ तयार केल्या गेल्या. या पेशी रेषा मूळ BY-2 पेशी रेषेसाठी वापरल्या जाणाऱ्या पद्धतींप्रमाणेच प्रक्रिया वापरून सांभाळल्या आणि समकालिक केल्या जाऊ शकतात.
HeLa पेशी 37°C तापमानाच्या इनक्यूबेटरमध्ये 5% CO2 सह, 10% फीटल बोवाइन सीरम, 1.2 U/ml पेनिसिलीन आणि 1.2 μg/ml स्ट्रेप्टोमाइसिनने पूरक असलेल्या डुलबेकोच्या सुधारित ईगल माध्यमात (DMEM) (लाइफ टेक्नॉलॉजीज) संवर्धित केल्या गेल्या.
या हस्तलिखितामध्ये वर्णन केलेले सर्व प्रयोग जपानच्या जैवसुरक्षा नियमावली आणि मार्गदर्शक तत्त्वांनुसार पार पाडण्यात आले.
संयुगे स्टॉक द्रावण म्हणून डायमिथाइल सल्फॉक्साइड (DMSO; फुजीफिल्म वाको प्युअर केमिकल) मध्ये विरघळवण्यात आली आणि अ‍ॅरेबिडोप्सिस व तंबाखूसाठी MS माध्यमात किंवा लिव्हरवर्टसाठी गॅम्बॉर्ग B5 माध्यमात विरल करण्यात आली. मुळांच्या वाढीस प्रतिबंध करण्याच्या चाचणीसाठी, प्रत्येक प्लेटमध्ये १० पेक्षा जास्त बिया, सूचित संयुगे किंवा DMSO असलेल्या आगर माध्यमावर पेरण्यात आल्या. बिया ७ दिवसांसाठी ग्रोथ चेंबरमध्ये ठेवण्यात आल्या. रोपांचे छायाचित्रण करण्यात आले आणि मुळांची लांबी मोजण्यात आली. अ‍ॅरेबिडोप्सिसच्या उगवण चाचणीसाठी, प्रत्येक प्लेटमध्ये ४८ बिया, २०० μM संयुग किंवा DMSO असलेल्या आगर माध्यमावर पेरण्यात आल्या. अ‍ॅरेबिडोप्सिसच्या बिया ग्रोथ चेंबरमध्ये वाढवण्यात आल्या आणि उगवणीनंतर ७ दिवसांनी (dag) उगवलेल्या रोपांची संख्या मोजण्यात आली. तंबाखूच्या उगवण चाचणीसाठी, प्रत्येक प्लेटमध्ये २४ बिया, २०० μM KAND किंवा DMSO असलेल्या आगर माध्यमावर पेरण्यात आल्या. तंबाखूच्या बिया ग्रोथ चेंबरमध्ये वाढवण्यात आल्या आणि १४ दिवसांनंतर उगवलेल्या रोपांची संख्या मोजण्यात आली. लिव्हरवर्ट वाढ प्रतिबंध चाचणीसाठी, प्रत्येक प्लेटमधील 9 भ्रूण KAND किंवा DMSO च्या सूचित केलेल्या सांद्रता असलेल्या आगर माध्यमावर प्लेट केले गेले आणि 14 दिवसांसाठी वाढ कक्षात उबवले गेले.
मूळ मेरिस्टेमची रचना पाहण्यासाठी 5 mg/ml प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) ने रंगवलेल्या रोपांचा वापर करा. टीसीएस एसपीई कॉन्फोकल लेसर स्कॅनिंग मायक्रोस्कोप (लायका मायक्रोसिस्टम्स) वापरून फ्लुरोसेन्स मायक्रोस्कोपीद्वारे पीआय सिग्नलचे निरीक्षण करण्यात आले.
मलामी आणि बेनफे36 यांनी वर्णन केलेल्या प्रोटोकॉलनुसार β-ग्लुक्युरोनिडेज (GUS) वापरून मुळांचे हिस्टोकेमिकल स्टेनिंग करण्यात आले. रोपे रात्रभर ९०% ॲसिटोनमध्ये स्थिर करण्यात आली, GUS बफरमधील ०.५ मिग्रॅ/मिली ५-ब्रोमो-४-क्लोरो-३-इंडोलिल-β-डी-ग्लुक्युरोनिक ॲसिडने १ तास रंगवण्यात आली आणि हायड्रेटेड क्लोराल्डिहाइड द्रावणात (८ ग्रॅम क्लोरल हायड्रेट, २ मिली पाणी आणि १ मिली ग्लिसरॉल) ठेवण्यात आली. त्यानंतर ॲक्सिओ इमेजर एम१ मायक्रोस्कोप (कार्ल झाईस) वापरून डिफरेंशियल इंटरफेरन्स कॉन्ट्रास्ट मायक्रोस्कोपीद्वारे त्यांचे निरीक्षण करण्यात आले.
उभ्या ठेवलेल्या प्लेट्सवर वाढवलेल्या ७ दिवसांच्या रोपांच्या मुळांचे कोन मोजण्यात आले. पायरी ६ मध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे गुरुत्वाकर्षण सदिशच्या दिशेपासून मुळाचा कोन मोजा.
प्रोटोकॉल ३७ मध्ये किरकोळ बदल करून, वर्णन केल्याप्रमाणे कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्सच्या मांडणीचे निरीक्षण करण्यात आले. अँटी-β-ट्युबुलिन अँटीबॉडी (KMX-1, मर्क मिलिपोर: MAB3408) आणि अलेक्सा फ्लोअर ४८८-कॉन्जुगेटेड अँटी-माऊस आयजीजी (थर्मो फिशर सायंटिफिक: A32723) यांचा वापर अनुक्रमे १:१००० आणि १:१०० विरलतेवर प्राथमिक आणि दुय्यम अँटीबॉडी म्हणून करण्यात आला. टीसीएस एसपीई कॉन्फोकल लेझर स्कॅनिंग मायक्रोस्कोप (लायका मायक्रोसिस्टम्स) वापरून फ्लुरोसन्स प्रतिमा मिळवण्यात आल्या. उत्पादकाच्या सूचनांनुसार झेड-स्टॅक प्रतिमा मिळवा आणि कमाल तीव्रता प्रोजेक्शन तयार करा.
उत्पादकाच्या सूचनांनुसार सेल काउंटिंग किट 8 (डोजिंडो) वापरून HeLa पेशी प्रसार चाचणी करण्यात आली.
स्पेक्ट्रोफोटोमीटर वापरून 600 nm (OD600) वर कल्चरमधील पेशी घनता मोजून E. coli DH5α च्या वाढीचे विश्लेषण केले गेले.
CSU-X1 कॉन्फोकल स्कॅनिंग डिव्हाइस (योकोगवा) आणि sCMOS कॅमेरा (झायला, अँडोर टेक्नॉलॉजी) असलेल्या फ्लुरोसेन्स मायक्रोस्कोपचा वापर करून ट्रान्सजेनिक BY-2 पेशींमधील सायटोस्केलेटल रचनेचे निरीक्षण करण्यात आले. वर्णन केल्यानुसार38,39, इमेजजे (ImageJ) सॉफ्टवेअर वापरून कॉन्फोकल इमेजेसमध्ये सायटोप्लाज्मिक पिक्सेल्समधील सायटोस्केलेटल पिक्सेल्सची टक्केवारी मोजून इमेज ॲनालिसिसद्वारे सायटोस्केलेटल घनतेचे मूल्यांकन करण्यात आले.
BY-2 पेशींमधील पेशी मृत्यू शोधण्यासाठी, पेशी निलंबनाचा एक भाग खोलीच्या तापमानावर १० मिनिटांसाठी ०.०५% इव्हान्स ब्लू सोबत उबवला गेला. मृत पेशींचे निवडक इव्हान्स ब्लू स्टैनिंग हे अखंड प्लाझ्मा पडद्याद्वारे जिवंत पेशींमधून रंगाच्या बाहेर टाकण्यावर अवलंबून असते⁴⁰. रंगवलेल्या पेशींचे निरीक्षण ब्राइट-फिल्ड मायक्रोस्कोप (BX53, ऑलिंपस) वापरून केले गेले.
HeLa पेशी 37°C आणि 5% CO2 असलेल्या आर्द्र इनक्यूबेटरमध्ये 10% FBS सह पूरक असलेल्या DMEM मध्ये वाढवण्यात आल्या. पेशींना 37°C तापमानावर 6 तासांसाठी 100 μM KAND 11, कुमामोनामिक ॲसिड 6, कुमामोनामाइड 1, 100 ng/ml कोल्सेमिड (गिब्को), किंवा 100 ng/ml नोकोडमेझ (सिग्मा) ने उपचारित करण्यात आले. पेशींना खोलीच्या तापमानावर 10 मिनिटांसाठी MetOH आणि नंतर 5 मिनिटांसाठी ॲसिटेटने स्थिर करण्यात आले. स्थिर केलेल्या पेशींना 0.5% BSA/PBS मध्ये विरल केलेल्या β-ट्युबुलिन प्राथमिक प्रतिपिंडासोबत (1D4A4, प्रोटीनटेक: 66240-1) 2 तासांसाठी इनक्यूबेट करण्यात आले, TBST ने 3 वेळा धुतले, आणि नंतर ॲलेक्सा फ्लुओर गोट प्रतिपिंडासोबत 1 तासासाठी इनक्यूबेट करण्यात आले. – माऊस आयजीजी (थर्मो फिशर सायंटिफिक: A11001) आणि 0.5% BSA/PBS मध्ये विरघळवलेले 15 ng/ml 4′,6-डायअमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (DAPI). TBST ने तीन वेळा धुतल्यानंतर, रंगवलेल्या पेशी निकॉन इक्लिप्स Ti-E इन्व्हर्टेड मायक्रोस्कोपवर पाहण्यात आल्या. मेटामॉर्फ सॉफ्टवेअर (मॉलिक्युलर डिव्हाइसेस) वापरून कूल्ड हमामात्सु ORCA-R2 CCD कॅमेऱ्याने प्रतिमा टिपण्यात आल्या.