पाइनच्या सूत्रकृमी रोगाचे प्रेरक म्हणून आयोडीन आणि ॲव्हरमेक्टिनचे मूल्यांकन

पाइन नेमाटोड हा एक क्वारंटाईन स्थलांतरित अंतःपरजीवी आहे, जो पाइनच्या जंगलातील परिसंस्थेमध्ये गंभीर आर्थिक नुकसान करतो. प्रस्तुत अभ्यासात पाइन नेमाटोडविरुद्ध हॅलोजनेटेड इंडोल्सच्या नेमाटोडनाशक क्रियाशीलतेचा आणि त्यांच्या कार्यप्रणालीचा आढावा घेतला आहे. पाइन नेमाटोडविरुद्ध ५-आयोडोइंडोल आणि ॲव्हरमेक्टिन (सकारात्मक नियंत्रण) यांची नेमाटोडनाशक क्रियाशीलता कमी सांद्रतेवर (१० μg/mL) समान आणि उच्च होती. ५-आयोडोइंडोलने प्रजननक्षमता, पुनरुत्पादक क्रियाशीलता, भ्रूण आणि अळीचा मृत्यूदर आणि हालचाल कमी केली. लिगँड्सची अपृष्ठवंशीय-विशिष्ट ग्लुटामेट-गेटेड क्लोराईड चॅनल रिसेप्टर्ससोबतची आण्विक आंतरक्रिया या कल्पनेला पुष्टी देते की, ॲव्हरमेक्टिनप्रमाणेच ५-आयोडोइंडोल रिसेप्टरच्या सक्रिय स्थळाशी घट्टपणे जोडला जातो. ५-आयोडोइंडोलने नेमाटोडमध्ये विविध बाह्यस्वरूपी विकृती देखील प्रेरित केल्या, ज्यात अवयवांचे असामान्यपणे कोसळणे/आकुंचन आणि रिक्तिकांचे वाढलेले प्रमाण यांचा समावेश होता. या निष्कर्षांवरून असे सूचित होते की नेमाटोडच्या मिथायलेशन-मध्यस्थ मृत्यूमध्ये रिक्तिकांची भूमिका असू शकते. महत्त्वाचे म्हणजे, ५-आयोडोइंडोल दोन्ही वनस्पती प्रजातींसाठी (कोबी आणि मुळा) बिनविषारी होते. अशाप्रकारे, हा अभ्यास दर्शवितो की पर्यावरणीय परिस्थितीत आयोडोइंडोलचा वापर पाइन विल्टमुळे होणारी इजा नियंत्रित करू शकतो.
पाइन वुड नेमाटोड (बर्साफेलेनकस झायलोफिलस) हा पाइन वुड नेमाटोड (PWN) या स्थलांतरित अंतःपरजीवी नेमाटोडच्या गटातील आहे, जो पाइनच्या जंगलातील परिसंस्थेचे गंभीर पर्यावरणीय नुकसान करतो¹. पाइन वुड नेमाटोडमुळे होणारा पाइन विल्ट रोग (PWD) हा आशिया आणि युरोपसह अनेक खंडांमध्ये एक गंभीर समस्या बनत आहे, आणि उत्तर अमेरिकेत, हा नेमाटोड बाहेरून आणलेल्या पाइनच्या प्रजाती नष्ट करतो¹,². पाइनच्या झाडांची घट ही एक मोठी आर्थिक समस्या आहे, आणि त्याच्या जागतिक प्रसाराची शक्यता चिंताजनक आहे³. खालील पाइन प्रजातींवर नेमाटोडचा हल्ला सर्वात सामान्यपणे होतो: पिनस डेन्सिफ्लोरा, पिनस सिल्व्हेस्ट्रिस, पिनस थुनबर्गी, पिनस कोरायन्सिस, पिनस थुनबर्गी, पिनस थुनबर्गी, आणि पिनस रेडिएटा⁴. पाइन नेमाटोड हा एक गंभीर रोग आहे जो संसर्गानंतर काही आठवड्यांत किंवा महिन्यांत पाइनची झाडे मारू शकतो. याशिवाय, विविध परिसंस्थांमध्ये पाइन नेमाटोडचा प्रादुर्भाव सामान्य आहे, त्यामुळे दीर्घकाळ टिकणाऱ्या संसर्गाच्या साखळ्या स्थापित झाल्या आहेत¹.
बर्साफेलेनकस झायलोफिलस हा अ‍ॅफेलेनकोइडीया महाकुळ आणि क्लेड १०२.५ मधील एक क्वारंटाईन वनस्पती-परजीवी सूत्रकृमी आहे. हा सूत्रकृमी बुरशीवर जगतो आणि पाइन वृक्षांच्या लाकडी ऊतींमध्ये प्रजनन करतो, जिथे तो L1, L2, L3, L4 या चार वेगवेगळ्या अळी अवस्थांमध्ये आणि एका प्रौढ जीवात विकसित होतो¹,⁶. अन्नाच्या कमतरतेच्या परिस्थितीत, पाइन सूत्रकृमी एका विशेष अळी अवस्थेत – डाउअरमध्ये – जातो, जी त्याच्या वाहकावर – पाइन बार्क बीटल (मोनोकॅमस अल्टरनाटस) वर परजीवी म्हणून जगते आणि निरोगी पाइन वृक्षांमध्ये संक्रमित होते. निरोगी यजमानांमध्ये, सूत्रकृमी वनस्पतींच्या ऊतींमधून वेगाने स्थलांतरित होतात आणि पॅरेनकायमेटस पेशींवर जगतात, ज्यामुळे संसर्गानंतर एका वर्षाच्या आत अनेक अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रिया, पाइन वृक्षांचे कोमेजणे आणि मृत्यू होतो¹,⁷,⁸.
पाइन नेमाटोड्सचे जैविक नियंत्रण हे फार पूर्वीपासून एक आव्हान राहिले आहे, ज्यासाठी २० व्या शतकापासून विलगीकरणाचे उपाय योजले जात आहेत. पाइन नेमाटोड्सच्या नियंत्रणासाठी सध्याच्या धोरणांमध्ये प्रामुख्याने रासायनिक उपचारांचा समावेश होतो, ज्यात लाकडाचे धुरीकरण आणि झाडांच्या खोडांमध्ये नेमाटिसाइड्सचे रोपण करणे यांचा समावेश आहे. सर्वात सामान्यपणे वापरले जाणारे नेमाटिसाइड्स म्हणजे ॲव्हरमेक्टिन आणि ॲव्हरमेक्टिन बेंझोएट, जे ॲव्हरमेक्टिन कुटुंबातील आहेत. ही महागडी रसायने अनेक नेमाटोड प्रजातींविरुद्ध अत्यंत प्रभावी आहेत आणि पर्यावरणाच्या दृष्टीने सुरक्षित मानली जातात⁹. तथापि, या नेमाटिसाइड्सच्या वारंवार वापरामुळे निवडक दबाव निर्माण होण्याची शक्यता आहे, ज्यामुळे जवळजवळ निश्चितपणे प्रतिरोधक पाइन नेमाटोड्सचा उदय होईल, जसे की लेप्टिनोटार्सा डेसेमलाइनटा, ​​प्लुटेला झायलोस्टेला आणि ट्रायकोस्ट्रॉन्गिलस कोलुब्रिफॉर्मिस व ऑस्टर्टाजिया सर्कमसिंक्टा यांसारख्या अनेक कीटकांच्या बाबतीत दिसून आले आहे, ज्यांनी हळूहळू ॲव्हरमेक्टिनला प्रतिकारशक्ती विकसित केली आहे¹⁰,¹¹,¹². म्हणून, PVD नियंत्रित करण्यासाठी पर्यायी, किफायतशीर आणि पर्यावरणास अनुकूल उपाय शोधण्याकरिता प्रतिकार पद्धतींचा नियमितपणे अभ्यास करणे आणि सूत्रकृमीनाशकांची सतत चाचणी करणे आवश्यक आहे. अलिकडच्या दशकांमध्ये, अनेक लेखकांनी सूत्रकृमी नियंत्रक घटक म्हणून वनस्पती अर्क, सुगंधी तेले आणि बाष्पशील पदार्थांचा वापर प्रस्तावित केला आहे13,14,15,16.
आम्ही अलीकडेच केनोर्हाब्डिटिस एलिगन्समध्ये इंडोलची सूत्रकृमीनाशक क्रियाशीलता प्रदर्शित केली आहे, जे एक आंतरपेशीय आणि आंतरराजकीय सिग्नलिंग रेणू आहे १७. इंडोल हे सूक्ष्मजीवशास्त्रीय परिसंस्थेतील एक व्यापक आंतरपेशीय सिग्नल आहे, जे सूक्ष्मजीवांचे शरीरशास्त्र, बीजाणू निर्मिती, प्लास्मिड स्थिरता, औषध प्रतिरोध, बायोफिल्म निर्मिती आणि विषारीपणा यांवर परिणाम करणाऱ्या असंख्य कार्यांवर नियंत्रण ठेवते १८, १९. इतर रोगजनक सूत्रकृमींविरुद्ध इंडोल आणि त्याच्या व्युत्पन्नांच्या क्रियाशीलतेचा अभ्यास केला गेला नाही. या अभ्यासात, आम्ही पाइन सूत्रकृमींविरुद्ध ३४ इंडोलच्या सूत्रकृमीनाशक क्रियाशीलतेचा तपास केला आणि मायक्रोस्कोपी, टाइम-लॅप्स फोटोग्राफी आणि मॉलिक्युलर डॉकिंग प्रयोगांचा वापर करून सर्वात प्रभावी ५-आयोडोइंडोलच्या कार्यप्रणालीचे स्पष्टीकरण दिले, तसेच बीज अंकुरण चाचणीचा वापर करून वनस्पतींवरील त्याच्या विषारी परिणामांचे मूल्यांकन केले.
इंडोलच्या उच्च सांद्रतेमुळे (>1.0 mM) सूत्रकृमींवर सूत्रकृमीनाशक परिणाम होतो असे पूर्वी नोंदवले गेले आहे¹⁷. बी. झायलोफिलस (मिश्र जीवन अवस्था) वर इंडोल किंवा ३३ वेगवेगळ्या इंडोल डेरिव्हेटिव्हजने १ mM सांद्रतेवर उपचार केल्यानंतर, नियंत्रण आणि उपचारित गटांमधील जिवंत आणि मृत सूत्रकृमींची गणना करून बी. झायलोफिलसच्या मृत्यूदराचे मोजमाप करण्यात आले. पाच इंडोल्सनी लक्षणीय सूत्रकृमीनाशक क्रिया दर्शविली; उपचार न केलेल्या नियंत्रण गटाचे २४ तासांनंतर जगण्याचे प्रमाण ९५ ± ७% होते. चाचणी केलेल्या ३४ इंडोल्सपैकी, १ mM सांद्रतेवर ५-आयोडोइंडोल आणि ४-फ्लोरोइंडोलमुळे १००% मृत्यू झाला, तर ५,६-डायफ्लोरोइंडिगो, मिथाइलइंडोल-७-कार्बोक्झिलेट आणि ७-आयोडोइंडोलमुळे अंदाजे ५०% मृत्यू झाला (तक्ता १).
पाइन वुड नेमाटोडच्या रिक्तिका निर्मिती आणि चयापचयावर ५-आयोडोइंडोलचा परिणाम. (अ) प्रौढ नर नेमाटोडवर ॲव्हरमेक्टिन आणि ५-आयोडोइंडोलचा परिणाम, (ब) एल१ अवस्थेतील नेमाटोडची अंडी आणि (क) बी. झायलोफिलसच्या चयापचयावर, (i) ० तासाला रिक्तिका आढळल्या नाहीत, उपचारामुळे (ii) रिक्तिका, (iii) अनेक रिक्तिकांचा संचय, (iv) रिक्तिकांची सूज, (v) रिक्तिकांचे एकत्रीकरण आणि (vi) महाकाय रिक्तिकांची निर्मिती झाली. लाल बाण रिक्तिकांची सूज, निळे बाण रिक्तिकांचे एकत्रीकरण आणि काळे बाण महाकाय रिक्तिका दर्शवतात. स्केल बार = ५० μm.
याव्यतिरिक्त, या अभ्यासात पाइन नेमाटोडमधील मिथेन-प्रेरित मृत्यूच्या अनुक्रमिक प्रक्रियेचेही वर्णन केले आहे (आकृती 4C). मिथेनोजेनिक मृत्यू हा पेशी मृत्यूचा एक नॉन-अपोप्टोटिक प्रकार आहे जो प्रमुख सायटोप्लाज्मिक व्हॅक्युओल्सच्या संचयनाशी संबंधित आहे²⁷. पाइन नेमाटोडमध्ये आढळलेले आकारिक दोष हे मिथेन-प्रेरित मृत्यूच्या यंत्रणेशी जवळून संबंधित असल्याचे दिसून येते. वेगवेगळ्या वेळी केलेल्या सूक्ष्मदर्शकीय तपासणीत असे दिसून आले की 5-आयोडोइंडोल (0.1 mM) च्या संपर्कात 20 तास ठेवल्यानंतर विशाल व्हॅक्युओल्स तयार झाले होते. उपचाराच्या 8 तासांनंतर सूक्ष्म व्हॅक्युओल्स दिसले आणि 12 तासांनंतर त्यांची संख्या वाढली. 14 तासांनंतर अनेक मोठे व्हॅक्युओल्स दिसले. उपचाराच्या 12-16 तासांनंतर अनेक जोडलेले व्हॅक्युओल्स स्पष्टपणे दिसत होते, जे दर्शवते की व्हॅक्युओलचे एकत्रीकरण हे मिथेनोजेनिक मृत्यूच्या यंत्रणेचा आधार आहे. 20 तासांनंतर, संपूर्ण कृमीमध्ये अनेक विशाल व्हॅक्युओल्स आढळले. ही निरीक्षणे सी. एलिगन्समध्ये मेटुओसिसचा पहिला अहवाल सादर करतात.
५-आयोडोइंडोलने उपचार केलेल्या कृमींमध्ये, रिक्तिकांचे एकत्रीकरण आणि फुटणे देखील दिसून आले (आकृती ५), जे कृमींच्या वाकण्यावरून आणि रिक्तिका वातावरणात सोडल्या जाण्यावरून सिद्ध झाले. अंड्याच्या कवचाच्या पडद्यामध्येही रिक्तिकांचे विघटन दिसून आले, जे सामान्यतः अंड्यातून बाहेर पडताना L2 द्वारे अखंड राखले जाते (पूरक आकृती S2). ही निरीक्षणे रिक्तिका निर्मिती आणि पू निर्मितीच्या प्रक्रियेत द्रव साचणे आणि परासरणीय नियमनातील बिघाड, तसेच प्रतिवर्ती पेशी इजा (RCI) यांच्या सहभागाला पुष्टी देतात (आकृती ५).
निरीक्षण केलेल्या रिक्तिका निर्मितीमध्ये आयोडीनच्या भूमिकेची गृहितक मांडून, आम्ही सोडियम आयोडाइड (NaI) आणि पोटॅशियम आयोडाइड (KI) यांच्या सूत्रकृमीनाशक क्रियाशीलतेचा अभ्यास केला. तथापि, ०.१, ०.५ किंवा १ mM या सांद्रतांवर, त्यांचा सूत्रकृमींच्या जगण्यावर किंवा रिक्तिका निर्मितीवर कोणताही परिणाम झाला नाही (पूरक आकृती S5), जरी १ mM KI चा किंचित सूत्रकृमीनाशक परिणाम दिसून आला. दुसरीकडे, ५-आयोडोइंडोलप्रमाणेच, ७-आयोडोइंडोलने (१ किंवा २ mM) अनेक रिक्तिका आणि रचनात्मक विकृती निर्माण केल्या (पूरक आकृती S6). या दोन आयोडोइंडोल्सनी पाइन सूत्रकृमींमध्ये समान बाह्यस्वरूपी वैशिष्ट्ये दर्शविली, तर NaI आणि KI ने तसे केले नाही. विशेष म्हणजे, तपासलेल्या सांद्रतांवर इंडोलने B. xylophilus मध्ये रिक्तिका निर्मिती केली नाही (माहिती दर्शविलेली नाही). अशाप्रकारे, या निष्कर्षांनी पुष्टी केली की इंडोल-आयोडीन कॉम्प्लेक्स हे B. xylophilus च्या रिक्तिका निर्मिती आणि चयापचयासाठी जबाबदार आहे.
सूत्रकृमीनाशक क्रियाशीलतेसाठी तपासलेल्या इंडोल्सपैकी, 5-आयोडोइंडोलचा स्लिप इंडेक्स -5.89 kcal/mol हा सर्वाधिक होता, त्यानंतर 7-आयोडोइंडोल (-4.48 kcal/mol), 4-फ्लोरोइंडोल (-4.33), आणि इंडोल (-4.03) यांचा क्रमांक होता (आकृती 6). 5-आयोडोइंडोलचे ल्युसिन 218 सोबतचे मजबूत बॅकबोन हायड्रोजन बंधन त्याच्या बंधनाला स्थिरता देते, तर इतर सर्व इंडोल डेरिव्हेटिव्ह्ज साइड चेन हायड्रोजन बंधांद्वारे सेरीन 260 ला जोडले जातात. इतर मॉडेल केलेल्या आयोडोइंडोल्सपैकी, 2-आयोडोइंडोलचे बंधन मूल्य -5.248 kcal/mol आहे, जे ल्युसिन 218 सोबतच्या त्याच्या मुख्य हायड्रोजन बंधामुळे आहे. इतर ज्ञात बंधनांमध्ये 3-आयोडोइंडोल (-4.3 kcal/mol), 4-आयोडोइंडोल (-4.0 kcal/mol), आणि 6-फ्लोरोइंडोल (-2.6 kcal/mol) यांचा समावेश आहे (पूरक आकृती S8). ५-आयोडोइंडोल आणि २-आयोडोइंडोल वगळता, बहुतेक हॅलोजनेटेड इंडोल्स आणि स्वतः इंडोल, सेरीन २६० सोबत बंध तयार करतात. ल्युसीन २१८ सोबत हायड्रोजन बंध तयार होणे हे कार्यक्षम रिसेप्टर-लिगँड बंधनाचे द्योतक आहे, जसे आयव्हरमेक्टिनमध्ये दिसून आले आहे (पूरक आकृती S7), यावरून हे सिद्ध होते की, ५-आयोडोइंडोल आणि २-आयोडोइंडोल, आयव्हरमेक्टिनप्रमाणेच, ल्युसीन २१८ मार्फत GluCL रिसेप्टरच्या सक्रिय स्थळाशी घट्टपणे जोडले जातात (आकृती ६ आणि पूरक आकृती S8). आमचा प्रस्ताव आहे की GluCL कॉम्प्लेक्सची खुली छिद्र रचना टिकवून ठेवण्यासाठी हे बंधन आवश्यक आहे आणि GluCL रिसेप्टरच्या सक्रिय स्थळाशी घट्टपणे जोडले जाऊन, ५-आयोडोइंडोल, २-आयोडोइंडोल, ॲव्हरमेक्टिन आणि आयव्हरमेक्टिन आयन चॅनेल उघडे ठेवतात आणि द्रव शोषणास परवानगी देतात.
GluCL ला इंडोल आणि हॅलोजनेटेड इंडोलचे आण्विक डॉकिंग. GluCL च्या सक्रिय स्थळाशी (A) इंडोल, (B) ४-फ्लोरोइंडोल, (C) ७-आयोडोइंडोल, आणि (D) ५-आयोडोइंडोल लिगँड्सच्या बंधनाची दिशा. प्रथिन एका रिबनने दर्शविले आहे, आणि बॅकबोन हायड्रोजन बंध पिवळ्या ठिपक्यांच्या रेषांनी दाखवले आहेत. (A′), (B′), (C′), आणि (D′) संबंधित लिगँड्सच्या सभोवतालच्या अमिनो आम्ल अवशेषांसोबतच्या आंतरक्रिया दर्शवतात, आणि साइड-चेन हायड्रोजन बंध गुलाबी ठिपक्यांच्या बाणांनी दर्शवले आहेत.
कोबी आणि मुळ्याच्या बियांच्या उगवणीवर ५-आयोडोइंडोलच्या विषारी परिणामाचे मूल्यांकन करण्यासाठी प्रयोग करण्यात आले. ५-आयोडोइंडोल (०.०५ किंवा ०.१ mM) किंवा ॲव्हरमेक्टिन (१० μg/mL) यांचा सुरुवातीच्या उगवणीवर आणि रोपांच्या उगवणीवर नगण्य किंवा कोणताही परिणाम झाला नाही (आकृती ७). याव्यतिरिक्त, उपचार न केलेल्या नियंत्रक बिया आणि ५-आयोडोइंडोल किंवा ॲव्हरमेक्टिनने उपचार केलेल्या बिया यांच्या उगवणीच्या दरात कोणताही लक्षणीय फरक आढळला नाही. मुख्य मुळाची लांबी आणि तयार झालेल्या बाजूच्या मुळांच्या संख्येवर याचा परिणाम नगण्य होता, जरी १ mM (त्याच्या सक्रिय सांद्रतेच्या १० पट) ५-आयोडोइंडोलने बाजूच्या मुळांच्या विकासास किंचित विलंब केला. हे परिणाम दर्शवतात की ५-आयोडोइंडोल वनस्पती पेशींसाठी बिनविषारी आहे आणि अभ्यासलेल्या सांद्रतेमध्ये वनस्पतींच्या विकास प्रक्रियेत हस्तक्षेप करत नाही.
बियांच्या उगवणीवर ५-आयोडोइंडोलचा परिणाम. अ‍ॅव्हरमेक्टिन किंवा ५-आयोडोइंडोलसह किंवा त्याशिवाय, मुराशीगे आणि स्कूग आगर माध्यमावर बी. ओलेरेसिया (B. oleracea) आणि आर. राफॅनिस्ट्रम (R. raphanistrum) बियांची उगवण, कोंब फुटणे आणि बाजूची मुळे फुटणे. २२°C तापमानात ३ दिवसांच्या उष्मायनानंतर उगवणीची नोंद घेण्यात आली.
या अभ्यासात इंडोल्सद्वारे सूत्रकृमींच्या मृत्यूची अनेक प्रकरणे नोंदवली आहेत. महत्त्वाचे म्हणजे, पाइनच्या सुईसारख्या पानांमध्ये आयोडोइंडोलद्वारे मिथायलेशन (लहान रिक्तिका जमा होऊन त्या हळूहळू मोठ्या रिक्तिकांमध्ये विलीन होण्याची प्रक्रिया, ज्यामुळे अखेरीस पटल फाटून सूत्रकृमींचा मृत्यू होतो) घडवून आणल्याचा हा पहिलाच अहवाल आहे. यामध्ये आयोडोइंडोलने व्यावसायिक सूत्रकृमीनाशक ॲव्हरमेक्टिनसारखेच लक्षणीय सूत्रकृमीनाशक गुणधर्म दर्शवले आहेत.
प्रोकॅरियोट्स आणि युकॅरियोट्समध्ये इंडोल्स अनेक सिग्नलिंग कार्ये करतात असे पूर्वी नोंदवले गेले आहे, ज्यात बायोफिल्म प्रतिबंध/निर्मिती, जिवाणूंचे अस्तित्व आणि रोगजनकता यांचा समावेश आहे19,32,33,34. अलीकडे, हॅलोजनेटेड इंडोल्स, इंडोल अल्कलॉइड्स आणि अर्ध-कृत्रिम इंडोल डेरिव्हेटिव्ह्जच्या संभाव्य उपचारात्मक परिणामांनी व्यापक संशोधन स्वारस्य आकर्षित केले आहे35,36,37. उदाहरणार्थ, हॅलोजनेटेड इंडोल्स चिवट एशेरिकिया कोलाय आणि स्टॅफिलोकोकस ऑरसच्या पेशींना मारतात असे दिसून आले आहे37. याव्यतिरिक्त, इतर प्रजाती, वंश आणि सृष्टींविरुद्ध हॅलोजनेटेड इंडोल्सच्या प्रभावीतेचा अभ्यास करणे वैज्ञानिक दृष्ट्या महत्त्वाचे आहे आणि हा अभ्यास हे उद्दिष्ट साध्य करण्याच्या दिशेने एक पाऊल आहे.
येथे, आम्ही C. elegans मध्ये 5-आयोडोइंडोल-प्रेरित प्राणघातकतेसाठी प्रतिवर्ती पेशी इजा (RCI) आणि मिथायलेशनवर आधारित एक यंत्रणा प्रस्तावित करतो (आकृती 4C आणि 5). सूज आणि रिक्तिकांचा ऱ्हास यांसारखे शोफयुक्त बदल हे RCI आणि मिथायलेशनचे सूचक आहेत, जे पेशीद्रव्यामध्ये विशाल रिक्तिकांच्या रूपात प्रकट होतात48,49. RCI एटीपी उत्पादन कमी करून, एटीपीएज पंपाच्या अपयशास कारणीभूत ठरून, किंवा पेशी पटलांना विस्कळीत करून आणि Na+, Ca2+, आणि पाण्याचा जलद अंतर्वाह घडवून ऊर्जा उत्पादनात व्यत्यय आणते50,51,52. Ca2+ आणि पाण्याच्या अंतर्वाहामुळे पेशीद्रव्यात द्रव साचल्याने प्राणी पेशींमध्ये आंतरपेशीद्रव्य रिक्तिका निर्माण होतात53. मनोरंजक म्हणजे, जर नुकसान तात्पुरते असेल तर पेशींच्या नुकसानीची ही यंत्रणा उलटवता येते आणि पेशी ठराविक कालावधीसाठी एटीपी तयार करू लागतात, परंतु जर नुकसान कायम राहिले किंवा वाढले तर पेशी मरतात.५४ आमच्या निरीक्षणातून असे दिसून आले आहे की ५-आयोडोइंडोलने उपचार केलेले नेमाटोड तणावपूर्ण परिस्थितीच्या संपर्कात आल्यानंतर सामान्य जैवसंश्लेषण पुनर्संचयित करण्यास असमर्थ आहेत.
B. xylophilus मध्ये 5-आयोडोइंडोलमुळे प्रेरित झालेला मिथायलेशन फेनोटाइप हा आयोडीनच्या उपस्थितीमुळे आणि त्याच्या आण्विक वितरणामुळे असू शकतो, कारण 7-आयोडोइंडोलचा B. xylophilus वर 5-आयोडोइंडोलपेक्षा कमी प्रतिबंधात्मक प्रभाव होता (तक्ता 1 आणि पूरक आकृती S6). हे परिणाम माल्टीज एट अल. (2014) यांच्या अभ्यासाशी अंशतः सुसंगत आहेत, ज्यांनी नोंदवले की इंडोलमधील पिरिडिल नायट्रोजन भागाचे पॅरा-स्थितीतून मेटा-स्थितीत स्थानांतरण केल्याने U251 पेशींमध्ये व्हॅक्युओलायझेशन, वाढ प्रतिबंध आणि सायटोटॉक्सिसिटी नाहीशी झाली, जे सूचित करते की रेणूची प्रथिनामधील विशिष्ट सक्रिय स्थळाशी होणारी आंतरक्रिया महत्त्वपूर्ण आहे27,44,45. या अभ्यासात इंडोल किंवा हॅलोजनेटेड इंडोल्स आणि GluCL रिसेप्टर्स यांच्यात आढळलेल्या आंतरक्रिया देखील या कल्पनेला समर्थन देतात, कारण तपासलेल्या इतर इंडोल्सपेक्षा 5- आणि 2-आयोडोइंडोल GluCL रिसेप्टर्सशी अधिक घट्टपणे बांधले गेल्याचे आढळले (आकृती 6 आणि पूरक आकृती S8). इंडोलच्या दुसऱ्या किंवा पाचव्या स्थानावरील आयोडीन, बॅकबोन हायड्रोजन बंधांद्वारे GluCL रिसेप्टरच्या ल्युसीन २१८ शी जोडले जाते असे आढळून आले, तर इतर हॅलोजनीकृत इंडोल्स आणि स्वतः इंडोल, सेरीन २६० सोबत कमकुवत साइड-चेन हायड्रोजन बंध तयार करतात (आकृती ६). त्यामुळे आम्ही असा अंदाज लावतो की, हॅलोजनचे स्थानिकीकरण व्हॅक्युओलर ऱ्हासाच्या प्रेरणेमध्ये महत्त्वाची भूमिका बजावते, तर ५-आयोडोइंडोलचे घट्ट बंधन आयन चॅनल उघडे ठेवते, ज्यामुळे द्रवाचा जलद अंतर्वाह आणि व्हॅक्युओल फुटण्यास वाव मिळतो. तथापि, ५-आयोडोइंडोलच्या कार्याची सविस्तर यंत्रणा अद्याप निश्चित करणे बाकी आहे.
५-आयोडोइंडोलच्या व्यावहारिक उपयोगापूर्वी, वनस्पतींवरील त्याच्या विषारी परिणामाचे विश्लेषण केले पाहिजे. आमच्या बीज उगवण प्रयोगांनी दाखवून दिले की, अभ्यासलेल्या सांद्रतेमध्ये ५-आयोडोइंडोलचा बीज उगवण किंवा त्यानंतरच्या विकास प्रक्रियांवर कोणताही नकारात्मक परिणाम झाला नाही (आकृती ७). अशाप्रकारे, हा अभ्यास पाइन वृक्षांना पाइन नेमाटोड्समुळे होणारी हानी नियंत्रित करण्यासाठी पर्यावरणीय वातावरणात ५-आयोडोइंडोलच्या वापरासाठी एक आधार प्रदान करतो.
मागील अहवालांनी असे दाखवून दिले आहे की इंडोल-आधारित उपचारपद्धती ही प्रतिजैविक प्रतिरोध आणि कर्करोगाच्या प्रगतीच्या समस्येवर उपाय करण्यासाठी एक संभाव्य दृष्टिकोन आहे⁵⁵. याव्यतिरिक्त, इंडोल्समध्ये जीवाणूरोधी, कर्करोगरोधी, अँटीऑक्सिडंट, दाहरोधी, मधुमेहरोधी, विषाणूरोधी, पेशीवृद्धीरोधी आणि क्षयरोगरोधी गुणधर्म आहेत आणि ते औषध विकासासाठी एक आश्वासक आधार ठरू शकतात⁵⁶,⁵⁷. हा अभ्यास प्रथमच आयोडीनचा परजीवीरोधी आणि कृमिरोधी घटक म्हणून संभाव्य वापर सुचवतो.
एव्हरमेक्टिनचा शोध तीन दशकांपूर्वी लागला आणि त्याला २०१५ मध्ये नोबेल पारितोषिक मिळाले. कृमिनाशक म्हणून त्याचा वापर अजूनही सक्रियपणे सुरू आहे. तथापि, सूत्रकृमी आणि कीटकांमध्ये एव्हरमेक्टिनला वेगाने प्रतिकारशक्ती विकसित होत असल्यामुळे, पाइन वृक्षांमधील पाइन सूत्रकृमींच्या (PWN) संसर्गावर नियंत्रण ठेवण्यासाठी एका पर्यायी, कमी खर्चाच्या आणि पर्यावरणपूरक उपायाची गरज आहे. या अभ्यासात ५-आयोडोइंडोल पाइन सूत्रकृमींना कसे मारते याची कार्यप्रणाली आणि वनस्पती पेशींसाठी त्याची कमी विषारीता यावरही प्रकाश टाकण्यात आला आहे, ज्यामुळे त्याच्या भविष्यातील व्यावसायिक वापरासाठी चांगल्या संधी निर्माण होतात.
सर्व प्रयोगांना कोरियातील ग्योंगसान येथील येओंगनाम विद्यापीठाच्या नीती समितीने मान्यता दिली होती आणि या पद्धती येओंगनाम विद्यापीठाच्या नीती समितीच्या मार्गदर्शक तत्त्वांनुसार पार पाडण्यात आल्या.
स्थापित कार्यपद्धती वापरून अंड्यांच्या उबवणीचे प्रयोग करण्यात आले⁴³. अंड्यातून पिल्लू बाहेर येण्याच्या दराचे (HR) मूल्यांकन करण्यासाठी, १-दिवसांच्या प्रौढ नेमाटोड्सना (अंदाजे १०० माद्या आणि १०० नर) बुरशी असलेल्या पेट्री डिशमध्ये स्थानांतरित करून २४ तास वाढू दिले. त्यानंतर अंडी वेगळी करून त्यांना निर्जंतुक डिस्टिल्ड वॉटरमधील निलंबनाच्या स्वरूपात ५-आयोडोइंडोल (०.०५ mM आणि ०.१ mM) किंवा ॲव्हरमेक्टिन (१० μg/ml) ने उपचारित करण्यात आले. हे निलंबन (५०० μl; अंदाजे १०० अंडी) २४-वेल टिश्यू कल्चर प्लेटच्या विहिरींमध्ये स्थानांतरित करून २२ °C तापमानावर उबवण्यात आले. उबवणीच्या २४ तासांनंतर L2 पेशींची गणना करण्यात आली, परंतु जर बारीक प्लॅटिनम वायरने उत्तेजित केल्यावर पेशी हलल्या नाहीत, तर त्यांना मृत मानले गेले. हा प्रयोग दोन टप्प्यांत, प्रत्येकी सहा पुनरावृत्तींसह आयोजित करण्यात आला होता. दोन्ही प्रयोगांमधील डेटा एकत्रित करून सादर करण्यात आला. HR ची टक्केवारी खालीलप्रमाणे मोजली जाते:
पूर्वी विकसित केलेल्या कार्यपद्धती वापरून अळ्यांच्या मृत्यूचे मूल्यांकन करण्यात आले. नेमाटोडची अंडी गोळा करण्यात आली आणि L2 अवस्थेतील अळ्या तयार करण्यासाठी निर्जंतुक डिस्टिल्ड वॉटरमध्ये उबवून भ्रूणांना समकालिक करण्यात आले. समकालिक केलेल्या अळ्यांवर (अंदाजे ५०० नेमाटोड) ५-आयोडोइंडोल (०.०५ mM आणि ०.१ mM) किंवा ॲव्हरमेक्टिन (१० μg/ml) ने प्रक्रिया करण्यात आली आणि त्यांना बी. सिनेरिया पेट्री प्लेट्सवर वाढवण्यात आले. २२ °C तापमानात ४८ तासांच्या उष्मायनानंतर, नेमाटोड निर्जंतुक डिस्टिल्ड वॉटरमध्ये गोळा करण्यात आले आणि त्यांच्यामध्ये L2, L3, आणि L4 अवस्थांच्या उपस्थितीसाठी तपासणी करण्यात आली. L3 आणि L4 अवस्थांची उपस्थिती अळीचे रूपांतरण दर्शवत होती, तर L2 अवस्थेची उपस्थिती कोणतेही रूपांतरण झाले नसल्याचे दर्शवत होती. iRiS™ डिजिटल सेल इमेजिंग सिस्टीम वापरून प्रतिमा मिळवण्यात आल्या. हा प्रयोग दोन टप्प्यांत, प्रत्येकी सहा पुनरावृत्तींसह आयोजित करण्यात आला होता. दोन्ही प्रयोगांमधील डेटा एकत्रित करून सादर करण्यात आला.
मुराशीगे आणि स्कुग आगर प्लेट्सवर अंकुरण चाचण्या वापरून बियांसाठी ५-आयोडोइंडोल आणि ॲव्हरमेक्टिनच्या विषारीपणाचे मूल्यांकन करण्यात आले.६२ बी. ओलेरेसिया आणि आर. राफॅनिस्ट्रमच्या बिया प्रथम एका दिवसासाठी निर्जंतुक डिस्टिल्ड वॉटरमध्ये भिजवण्यात आल्या, १ मिली १००% इथेनॉलने धुतल्या गेल्या, १ मिली ५०% व्यावसायिक ब्लीच (३% सोडियम हायपोक्लोराइट) ने १५ मिनिटांसाठी निर्जंतुक करण्यात आल्या आणि १ मिली निर्जंतुक पाण्याने पाच वेळा धुतल्या गेल्या. त्यानंतर निर्जंतुक केलेल्या बिया ०.८६ ग्रॅम/लिटर (०.२X) मुराशीगे आणि स्कुग माध्यम आणि ०.७% बॅक्टेरियोलॉजिकल आगर असलेल्या अंकुरण आगर प्लेट्सवर दाबण्यात आल्या, ज्यात ५-आयोडोइंडोल किंवा ॲव्हरमेक्टिन होते किंवा नव्हते. त्यानंतर प्लेट्स २२°C तापमानावर इनक्युबेट करण्यात आल्या आणि ३ दिवसांच्या इनक्युबेशननंतर प्रतिमा घेण्यात आल्या. हा प्रयोग दोन टप्प्यांत करण्यात आला, ज्यातील प्रत्येक टप्प्याची सहा वेळा पुनरावृत्ती करण्यात आली.