ज्वारीमधील एमएएमपी-प्रेरित संरक्षण प्रतिसादाची शक्ती आणि लक्ष्य पानांवरील ठिपक्यांच्या रोगाला असलेला प्रतिकार यांचे जीनोम-व्यापी सहसंबंध विश्लेषण

वनस्पती आणि रोगकारक सामग्री

इलिनॉय विद्यापीठातील (आता यूसी डेव्हिस येथे) डॉ. पॅट ब्राउन यांनी सोरघम कन्व्हर्जन पॉप्युलेशन (SCP) नावाची ज्वारीची एक असोसिएशन मॅपिंग पॉप्युलेशन उपलब्ध करून दिली. तिचे वर्णन पूर्वी करण्यात आले आहे आणि ती विविध वाणांचा एक संग्रह आहे, ज्यांना अमेरिकेतील वातावरणात वनस्पतींची वाढ आणि विकास सुलभ करण्यासाठी प्रकाश-कालावधी-संवेदनशीलता आणि लहान उंचीमध्ये रूपांतरित केले गेले आहे. या अभ्यासात या पॉप्युलेशनमधील ५१० वाणांचा वापर करण्यात आला, तथापि, खराब उगवण आणि इतर गुणवत्ता नियंत्रण समस्यांमुळे, तिन्ही गुणधर्मांच्या विश्लेषणासाठी सर्व वाणांचा वापर केला गेला नाही. अखेरीस, चिटिन प्रतिसादाच्या विश्लेषणासाठी ३४५ वाणांचा, flg22 प्रतिसादासाठी ४७२ वाणांचा आणि TLS प्रतिकारशक्तीसाठी ४५६ वाणांचा डेटा वापरण्यात आला.बी. कुकीस्ट्रेन LSLP18 आर्कान्सास विद्यापीठातील डॉ. बर्ट ब्लुहम यांच्याकडून मिळवण्यात आला.

MAMP प्रतिसाद मापन

या अभ्यासात flg22 (जेनस्क्रिप्ट कॅटलॉग# RP19986) आणि कायटिन हे दोन भिन्न MAMPs वापरण्यात आले. ग्रीनहाऊसमध्ये, मातीने (३३% सनशाईन रेडि-अर्थ प्रो ग्रोइंग मिक्स) भरलेल्या ट्रेवर ठेवलेल्या इन्सर्टमध्ये ज्वारीची रोपे वाढवण्यात आली. नमुना संकलनाच्या दिवशी पानांवर अतिरिक्त ओलावा येऊ नये म्हणून, नमुना संकलनाच्या आदल्या दिवशी रोपांना पाणी देण्यात आले.

ओळींची यादृच्छिक निवड करण्यात आली आणि व्यवस्थापकीय सोयीसाठी, त्यांची लागवड ६० ओळींच्या तुकड्यांमध्ये करण्यात आली. प्रत्येक ओळीसाठी, तीन 'कुंड्यां'मध्ये प्रति ओळ दोन बिया लावून लागवड करण्यात आली. संपूर्ण लोकसंख्येचे मूल्यांकन होईपर्यंत, आधीच्या तुकड्यावर प्रक्रिया होताच पुढील तुकड्यांची लागवड करण्यात आली. दोन्ही MAMPs साठी दोन प्रायोगिक फेऱ्या घेण्यात आल्या आणि प्रत्येक फेरीत जनुकीय प्रकारांची पुन्हा यादृच्छिक निवड करण्यात आली.

आरओएस चाचण्या पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे करण्यात आल्या. थोडक्यात, प्रत्येक ओळीसाठी, ३ वेगवेगळ्या कुंड्यांमध्ये सहा बिया लावण्यात आल्या. त्यातून तयार झालेल्या रोपांमधून, एकसारखेपणाच्या आधारावर तीन रोपे निवडण्यात आली. जी रोपे असामान्य दिसत होती किंवा बहुसंख्य रोपांपेक्षा लक्षणीयरीत्या उंच किंवा बुटकी होती, त्यांचा वापर केला गेला नाही. तीन वेगवेगळ्या १५-दिवसांच्या ज्वारीच्या रोपांच्या चौथ्या पानाच्या सर्वात रुंद भागातून ३ मिमी व्यासाच्या चार चकत्या कापून काढण्यात आल्या. दोन रोपांमधून प्रत्येक पानाची एक चकती आणि एका रोपातून दोन चकत्या, ज्यातील दुसरी चकती पाण्याचे नियंत्रण (वॉटर कंट्रोल) म्हणून वापरली गेली (खाली पहा). या चकत्या एका काळ्या ९६-वेल प्लेटमध्ये ५० µl H2O वर स्वतंत्रपणे तरंगत ठेवण्यात आल्या, प्रकाशाचा संपर्क टाळण्यासाठी ॲल्युमिनियम सीलने बंद करण्यात आल्या आणि रात्रभर खोलीच्या तापमानावर ठेवण्यात आल्या. दुसऱ्या दिवशी सकाळी, २ मिग्रॅ/मिलि केमिल्युमिनेसेंट प्रोब एल-०१२ (वाको, कॅटलॉग # १२०-०४८९१), २ मिग्रॅ/मिलि हॉर्सरॅडिश पेरॉक्सिडेज (प्रकार VI-A, सिग्मा-अल्ड्रिच, कॅटलॉग # P६७८२), आणि १०० मिग्रॅ/मिलि कायटिन किंवा २ μM Flg22 वापरून एक अभिक्रिया द्रावण तयार करण्यात आले. या अभिक्रिया द्रावणाचे ५० µl चारपैकी तीन विहिरींमध्ये (wells) टाकण्यात आले. चौथी विहीर एक मॉक कंट्रोल होती, ज्यामध्ये MAMP वगळून अभिक्रिया द्रावण टाकण्यात आले. प्रत्येक प्लेटमध्ये फक्त पाणी असलेल्या चार रिकाम्या विहिरींचा (blank wells) देखील समावेश करण्यात आला होता.

अभिक्रिया द्रावण टाकल्यानंतर, बायोटेकच्या सिनर्जीटीएम २ मल्टी-डिटेक्शन मायक्रोप्लेट रीडरचा वापर करून १ तासासाठी दर २ मिनिटांनी ल्युमिनेसन्स मोजण्यात आले. या १ तासादरम्यान प्लेट रीडर दर २ मिनिटांनी ल्युमिनेसन्सचे मापन करतो. प्रत्येक वेलचे मूल्य मिळवण्यासाठी सर्व ३१ रीडिंग्जची बेरीज करण्यात आली. प्रत्येक जीनोटाइपसाठी एमएएमपी (MAMP) प्रतिसादाचे अंदाजित मूल्य (तीन प्रायोगिक वेल्सच्या सरासरी ल्युमिनेसन्स मूल्यामधून - मॉक वेलचे मूल्य) वजा ब्लँक वेलचे सरासरी मूल्य, असे मोजण्यात आले. ब्लँक वेलची मूल्ये सातत्याने शून्याच्या जवळ होती.

पानांच्या चकत्यानिकोटियाना बेंथामियानागुणवत्ता नियंत्रणाच्या उद्देशाने प्रत्येक 96-वेल प्लेटमध्ये नियंत्रक म्हणून एक उच्च प्रतिसाद देणारी ज्वारीची वाण (SC0003) आणि एक कमी प्रतिसाद देणारी ज्वारीची वाण (PI 6069) देखील समाविष्ट करण्यात आली होती.

बी. कुकीइनोक्युलमची तयारी आणि इनोक्युलेशन

बी. कुकीपूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे इनोक्युलम तयार करण्यात आले. थोडक्यात, ज्वारीचे दाणे तीन दिवस पाण्यात भिजवून, स्वच्छ धुऊन, १ लिटरच्या शंकूच्या आकाराच्या फ्लास्कमध्ये भरून १५ पीएसआय (psi) आणि १२१°C तापमानावर एका तासासाठी ऑटोक्लेव्ह करण्यात आले. त्यानंतर, ताज्या कल्चरमधून घेतलेल्या सुमारे ५ मिली मॅसरेटेड मायसेलियाने (विरघळलेल्या बुरशीच्या तंतूंनी) या दाण्यांना इनोक्युलेट करण्यात आले.बी. कुकीLSLP18 आयसोलेट्स वापरून फ्लास्क खोलीच्या तापमानावर २ आठवड्यांसाठी ठेवण्यात आले आणि दर ३ दिवसांनी ते हलवण्यात आले. २ आठवड्यांनंतर, बुरशीने संक्रमित झालेले ज्वारीचे दाणे हवेत वाळवून, शेतात संसर्ग होईपर्यंत ४°C तापमानावर साठवण्यात आले. संपूर्ण प्रयोगासाठी तेच इनोक्युलम वापरण्यात आले आणि ते दरवर्षी ताजे तयार केले जात होते. संसर्गासाठी, ४-५ आठवड्यांच्या ज्वारीच्या रोपांच्या शेंड्यावर ६-१० संक्रमित दाणे ठेवण्यात आले. या बुरशीपासून तयार झालेल्या बीजाणूंनी एका आठवड्याच्या आत ज्वारीच्या लहान रोपांमध्ये संसर्ग सुरू केला.

बियाणे तयार करणे

शेतात पेरणी करण्यापूर्वी ज्वारीच्या बियाण्यांवर बुरशीनाशक, कीटकनाशक आणि सेफनरच्या मिश्रणाने प्रक्रिया करण्यात आली, ज्यात सुमारे १% स्पिराटो ४८० एफएस बुरशीनाशक, ४% सेब्रिंग ४८० एफएस बुरशीनाशक आणि ३% सोरप्रो ९४० ईएस सीड सेफनर होते. त्यानंतर बियाणे ३ दिवस हवेत वाळवण्यात आले, ज्यामुळे बियाण्यांभोवती या मिश्रणाचा एक पातळ थर तयार झाला. या सेफनरमुळे ड्युअल मॅग्नम या तणनाशकाचा वापर उगवणपूर्व उपचार म्हणून करणे शक्य झाले.

टार्गेट लीफ स्पॉट प्रतिकारशक्तीचे मूल्यांकन

क्लेटन, एनसी येथील सेंट्रल क्रॉप्स रिसर्च स्टेशनमध्ये १४-१५ जून २०१७ आणि २० जून २०१८ रोजी एससीपीची लागवड यादृच्छिक पूर्ण गट रचनेनुसार (randomized complete block design) करण्यात आली, ज्यात प्रत्येक बाबतीत दोन प्रायोगिक पुनरावृत्ती होत्या. प्रयोग १.८ मीटर एकेरी ओळींमध्ये, ०.९ मीटर ओळीच्या रुंदीसह, प्रति प्लॉट १० बिया वापरून लावण्यात आले. कडेचा परिणाम टाळण्यासाठी प्रत्येक प्रयोगाच्या परिघाभोवती दोन सीमा ओळी लावण्यात आल्या. २० जुलै २०१७ आणि २० जुलै २०१८ रोजी प्रयोगांमध्ये रोगजंतुसंसर्ग करण्यात आला, त्यावेळी ज्वारीची रोपे वाढीच्या तिसऱ्या टप्प्यावर होती. एक ते नऊच्या प्रमाणावर मूल्यांकन करण्यात आले, ज्यात रोगाची कोणतीही लक्षणे न दाखवणाऱ्या रोपांना नऊ आणि पूर्णपणे मृत रोपांना एक गुण देण्यात आला. २०१७ मध्ये दोन आणि २०१८ मध्ये चार मूल्यांकने घेण्यात आली, जी प्रत्येक वर्षी रोगजंतुसंसर्गानंतर दोन आठवड्यांनी सुरू झाली. sAUDPC (रोग प्रगती वक्राखालील प्रमाणित क्षेत्र) ची गणना पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे करण्यात आली.