लहान जलचर टॅडपोलसाठी व्यावसायिक सायपरमेथ्रिन तयारीचा मृत्यू आणि विषारीपणा

या अभ्यासात व्यावसायिक औषधांची प्राणघातकता, सूक्ष्मता आणि विषारीपणाचे मूल्यांकन केले गेलेसायपरमेथ्रीनअनुरन टॅडपोल्ससाठी फॉर्म्युलेशन. तीव्र चाचणीमध्ये, 100-800 μg/L च्या सांद्रतेची 96 तासांसाठी चाचणी करण्यात आली. क्रॉनिक चाचणीमध्ये, नैसर्गिकरित्या उद्भवणाऱ्या सायपरमेथ्रिन सांद्रतेची (1, 3, 6, आणि 20 μg/L) मृत्युदरासाठी चाचणी करण्यात आली, त्यानंतर मायक्रोन्यूक्लियस चाचणी आणि 7 दिवसांसाठी लाल रक्तपेशी न्यूक्लियर असामान्यता चाचणी करण्यात आली. टॅडपोल्ससाठी व्यावसायिक सायपरमेथ्रिन फॉर्म्युलेशनचे LC50 273.41 μg L−1 होते. क्रॉनिक चाचणीमध्ये, सर्वाधिक एकाग्रता (20 μg L−1) मुळे 50% पेक्षा जास्त मृत्युदर झाला, कारण त्याने चाचणी केलेल्या अर्ध्या टॅडपोल्सना मारले. मायक्रोन्यूक्लियस चाचणीने 6 आणि 20 μg L−1 वर लक्षणीय परिणाम दर्शविले आणि अनेक न्यूक्लियर असामान्यता आढळून आल्या, जे दर्शविते की व्यावसायिक सायपरमेथ्रिन फॉर्म्युलेशनमध्ये पी. ग्रॅसिलिस विरुद्ध जीनोटॉक्सिक क्षमता आहे. सायपरमेथ्रिन हे या प्रजातीसाठी उच्च धोका आहे, जे दर्शवते की ते अनेक समस्या निर्माण करू शकते आणि अल्प आणि दीर्घकालीन या परिसंस्थेच्या गतिशीलतेवर परिणाम करू शकते. म्हणूनच, असा निष्कर्ष काढता येतो की व्यावसायिक सायपरमेथ्रिन फॉर्म्युलेशनचा पी. ग्रॅसिलिसवर विषारी परिणाम होतो.
कृषी उपक्रमांच्या सतत विस्तारामुळे आणि सघन वापरामुळेकीटक नियंत्रणउपाय, जलचर प्राणी वारंवार कीटकनाशकांच्या संपर्कात येतात१,२. शेतीच्या जवळील जलस्रोतांचे प्रदूषण उभयचर प्राण्यांसारख्या लक्ष्य नसलेल्या जीवांच्या विकासावर आणि अस्तित्वावर परिणाम करू शकते.
पर्यावरणीय मॅट्रिक्सच्या मूल्यांकनात उभयचर प्राणी अधिकाधिक महत्त्वाचे होत आहेत. जटिल जीवनचक्र, जलद अळ्यांचा विकास दर, उष्णकटिबंधीय स्थिती, पारगम्य त्वचा10,11, पुनरुत्पादनासाठी पाण्यावर अवलंबून राहणे12 आणि असुरक्षित अंडी11,13,14 यासारख्या त्यांच्या अद्वितीय वैशिष्ट्यांमुळे अनुरन्सना पर्यावरणीय प्रदूषकांचे चांगले जैव निर्देशक मानले जाते. लहान पाण्यातील बेडूक (फिजॅलेमस ग्रॅसिलिस), ज्याला सामान्यतः रडणारा बेडूक म्हणून ओळखले जाते, कीटकनाशक प्रदूषण4,5,6,7,15 ची जैव निर्देशक प्रजाती असल्याचे दर्शविले गेले आहे. ही प्रजाती अर्जेंटिना, उरुग्वे, पॅराग्वे आणि ब्राझीलमध्ये स्थिर पाण्यात, संरक्षित भागात किंवा परिवर्तनशील अधिवास असलेल्या भागात आढळते1617 आणि विविध अधिवासांच्या विस्तृत वितरण आणि सहनशीलतेमुळे IUCN वर्गीकरणानुसार स्थिर मानली जाते18.
सायपरमेथ्रिनच्या संपर्कात आल्यानंतर उभयचरांमध्ये सूक्ष्मघातक परिणाम नोंदवले गेले आहेत, ज्यामध्ये टॅडपोलमध्ये वर्तणुकीय, आकारशास्त्रीय आणि जैवरासायनिक बदल 23,24,25, बदललेला मृत्युदर आणि रूपांतर वेळ, एंजाइमॅटिक बदल, अंडी उबवण्याच्या यशात घट 24,25, अतिक्रियाशीलता 26, कोलिनेस्टेरेस क्रियाकलाप प्रतिबंध 27 आणि पोहण्याच्या कामगिरीतील बदल 7,28 यांचा समावेश आहे. तथापि, उभयचरांमध्ये सायपरमेथ्रिनच्या जीनोटॉक्सिक प्रभावांचे अभ्यास मर्यादित आहेत. म्हणून, अनुरन प्रजातींची सायपरमेथ्रिनसाठी संवेदनशीलता मूल्यांकन करणे महत्वाचे आहे.
पर्यावरणीय प्रदूषणामुळे उभयचरांच्या सामान्य वाढीवर आणि विकासावर परिणाम होतो, परंतु सर्वात गंभीर प्रतिकूल परिणाम म्हणजे कीटकनाशकांच्या संपर्कामुळे होणारे डीएनएचे अनुवांशिक नुकसान १३. रक्त पेशी आकारविज्ञान विश्लेषण हे प्रदूषण आणि वन्य प्रजातींना पदार्थाच्या संभाव्य विषारीपणाचे एक महत्त्वाचे जैवसूचक आहे २९. वातावरणातील रसायनांची जीनोटॉक्सिसिटी निश्चित करण्यासाठी सूक्ष्मन्यूक्लियस चाचणी ही सर्वात सामान्यपणे वापरल्या जाणाऱ्या पद्धतींपैकी एक आहे ३०. ही एक जलद, प्रभावी आणि स्वस्त पद्धत आहे जी उभयचरांसारख्या जीवांच्या रासायनिक प्रदूषणाचे चांगले सूचक आहे ३१,३२ आणि जीनोटॉक्सिक प्रदूषकांच्या संपर्कात येण्याबद्दल माहिती प्रदान करू शकते ३३.
या अभ्यासाचा उद्देश सूक्ष्मन्यूक्लियस चाचणी आणि पर्यावरणीय जोखीम मूल्यांकन वापरून लहान जलीय टॅडपोलमध्ये व्यावसायिक सायपरमेथ्रिन फॉर्म्युलेशनच्या विषारी क्षमतेचे मूल्यांकन करणे होते.
चाचणीच्या तीव्र कालावधीत व्यावसायिक सायपरमेथ्रिनच्या वेगवेगळ्या सांद्रतांच्या संपर्कात आलेल्या पी. ग्रॅसिलिस टॅडपोल्सचे संचयी मृत्युदर (%).
दीर्घकालीन चाचणी दरम्यान व्यावसायिक सायपरमेथ्रिनच्या वेगवेगळ्या सांद्रतांच्या संपर्कात आलेल्या पी. ग्रॅसिलिस टॅडपोल्सचे संचयी मृत्युदर (%).
सायपरमेथ्रिनच्या वेगवेगळ्या सांद्रतांच्या संपर्कात आलेल्या उभयचर प्राण्यांमध्ये जीनोटॉक्सिक प्रभावामुळे (6 आणि 20 μg/L) आढळून आले, जे लाल रक्तपेशींमध्ये सूक्ष्मन्यूक्ली (MN) आणि न्यूक्लियर असामान्यतांच्या उपस्थितीमुळे दिसून येते. MN ची निर्मिती मायटोसिसमधील त्रुटी दर्शवते आणि ते सूक्ष्मनलिकांसोबत गुणसूत्रांचे खराब बंधन, गुणसूत्र शोषण आणि वाहतुकीसाठी जबाबदार असलेल्या प्रथिने संकुलांमधील दोष, गुणसूत्र पृथक्करणातील त्रुटी आणि DNA नुकसान दुरुस्तीमधील त्रुटींशी संबंधित आहे38,39 आणि कीटकनाशक-प्रेरित ऑक्सिडेटिव्ह ताणाशी संबंधित असू शकते40,41. मूल्यांकन केलेल्या सर्व सांद्रतांमध्ये इतर असामान्यता आढळून आल्या. सायपरमेथ्रिनच्या सांद्रतेत वाढ झाल्याने लाल रक्तपेशींमध्ये सर्वात कमी (1 μg/L) आणि सर्वोच्च (20 μg/L) डोसमध्ये अनुक्रमे 5% आणि 20% ने न्यूक्लियर असामान्यता वाढली. उदाहरणार्थ, प्रजातीच्या DNA मधील बदलांमुळे अल्पकालीन आणि दीर्घकालीन जगण्यासाठी गंभीर परिणाम होऊ शकतात, परिणामी लोकसंख्या घट, प्रजनन तंदुरुस्ती बदलणे, प्रजनन क्षमता बदलणे, अनुवांशिक विविधतेचे नुकसान आणि बदललेले स्थलांतर दर. हे सर्व घटक प्रजातींच्या अस्तित्वावर आणि देखभालीवर परिणाम करू शकतात42,43. एरिथ्रॉइड असामान्यता निर्माण होणे सायटोकायनेसिसमध्ये अडथळा दर्शवू शकते, ज्यामुळे असामान्य पेशी विभाजन (बायन्युक्लेटेड एरिथ्रोसाइट्स)44,45 होते; मल्टीलोब्ड न्यूक्ली हे अनेक लोब असलेल्या न्यूक्लियर झिल्लीचे प्रोट्र्यूशन असतात46, तर इतर एरिथ्रॉइड असामान्यता डीएनए अॅम्प्लिफिकेशनशी संबंधित असू शकतात, जसे की न्यूक्लियर किडनी/ब्लेब्स47. एन्युक्लेटेड एरिथ्रोसाइट्सची उपस्थिती ऑक्सिजन वाहतुकीत बिघाड दर्शवू शकते, विशेषतः दूषित पाण्यात48,49. अपोप्टोसिस पेशी मृत्यू दर्शवते50.
इतर अभ्यासांनी सायपरमेथ्रिनचे जीनोटॉक्सिक प्रभाव देखील दर्शविले आहेत. कबाना एट अल.51 ने सायपरमेथ्रिनच्या उच्च सांद्रतेच्या (5000 आणि 10,000 μg L−1) 96 तासांच्या संपर्कात आल्यानंतर ओडोंटोफ्रायनस अमेरिकनस पेशींमध्ये सूक्ष्मन्यूक्ली आणि बायन्यूक्लीएटेड पेशी आणि अपोप्टोटिक पेशींसारखे न्यूक्लियर बदलांची उपस्थिती दर्शविली. पी. बिलीगोनिगेरस52 आणि राइनेल अरेनारम53 मध्ये देखील सायपरमेथ्रिन-प्रेरित एपोप्टोसिस आढळून आला. हे निकाल सूचित करतात की सायपरमेथ्रिनचा जलचर जीवांच्या श्रेणीवर जीनोटॉक्सिक प्रभाव असतो आणि MN आणि ENA परख उभयचरांवर उपघातक प्रभावांचे सूचक असू शकते आणि विषारी पदार्थांच्या संपर्कात येणाऱ्या स्थानिक प्रजाती आणि वन्य लोकसंख्येला लागू होऊ शकते12.
सायपरमेथ्रिनच्या व्यावसायिक सूत्रीकरणामुळे पर्यावरणाला मोठा धोका निर्माण होतो (तीव्र आणि जुनाट दोन्ही), मुख्यालये यूएस एन्व्हायर्नमेंटल प्रोटेक्शन एजन्सी (EPA) पातळी 54 पेक्षा जास्त असतात जी वातावरणात असल्यास प्रजातींवर प्रतिकूल परिणाम करू शकतात. क्रॉनिक रिस्क असेसमेंटमध्ये, मृत्युदरासाठी NOEC 3 μg L−1 होता, ज्यामुळे पुष्टी होते की पाण्यात आढळणारे सांद्रता प्रजातींसाठी धोका निर्माण करू शकते55. एंडोसल्फान आणि सायपरमेथ्रिनच्या मिश्रणाच्या संपर्कात आलेल्या R. अरेनारम अळ्यांसाठी प्राणघातक NOEC 168 तासांनंतर 500 μg L−1 होता; हे मूल्य 336 तासांनंतर 0.0005 μg L−1 पर्यंत कमी झाले. लेखक दर्शवितात की जितका जास्त काळ संपर्कात राहाल तितकी प्रजातींसाठी हानिकारक सांद्रता कमी होईल. हे देखील अधोरेखित करणे महत्त्वाचे आहे की त्याच संपर्काच्या वेळी NOEC मूल्ये P. gracilis पेक्षा जास्त होती, हे दर्शविते की सायपरमेथ्रिनला प्रजातींचा प्रतिसाद प्रजाती-विशिष्ट आहे. शिवाय, मृत्युदराच्या बाबतीत, सायपरमेथ्रिनच्या संपर्कात आल्यानंतर पी. ग्रॅसिलिसचे CHQ मूल्य 64.67 पर्यंत पोहोचले, जे यूएस पर्यावरण संरक्षण एजन्सी54 ने सेट केलेल्या संदर्भ मूल्यापेक्षा जास्त आहे आणि आर. अरेनारम अळ्यांचे CHQ मूल्य देखील या मूल्यापेक्षा जास्त होते (336 तासांनंतर CHQ > 388.00), जे दर्शविते की अभ्यासलेले कीटकनाशके अनेक उभयचर प्रजातींसाठी उच्च धोका निर्माण करतात. पी. ग्रॅसिलिसला रूपांतर पूर्ण करण्यासाठी अंदाजे 30 दिवस लागतात हे लक्षात घेता, असा निष्कर्ष काढता येतो की सायपरमेथ्रिनचे अभ्यासलेले सांद्रता संक्रमित व्यक्तींना लहान वयात प्रौढ किंवा पुनरुत्पादक अवस्थेत प्रवेश करण्यापासून रोखून लोकसंख्या घटण्यास हातभार लावू शकते.
मायक्रोन्यूक्ली आणि इतर एरिथ्रोसाइट न्यूक्लियर असामान्यतांच्या गणना केलेल्या जोखीम मूल्यांकनात, CHQ मूल्ये 14.92 ते 97.00 पर्यंत होती, जे दर्शविते की सायपरमेथ्रिनला त्याच्या नैसर्गिक अधिवासातही पी. ग्रॅसिलिससाठी संभाव्य जीनोटॉक्सिक धोका होता. मृत्युदर लक्षात घेता, पी. ग्रॅसिलिसला सहन करण्यायोग्य झेनोबायोटिक संयुगांची कमाल एकाग्रता 4.24 μg L−1 होती. तथापि, 1 μg/L इतक्या कमी सांद्रतांमध्ये देखील जीनोटॉक्सिक प्रभाव दिसून आला. या वस्तुस्थितीमुळे असामान्य व्यक्तींच्या संख्येत वाढ होऊ शकते57 आणि त्यांच्या अधिवासातील प्रजातींच्या विकास आणि पुनरुत्पादनावर परिणाम होऊ शकतो, ज्यामुळे उभयचर लोकसंख्येत घट होऊ शकते.
सायपरमेथ्रिन या कीटकनाशकाच्या व्यावसायिक सूत्रीकरणात पी. ​​ग्रॅसिलिसला उच्च तीव्र आणि दीर्घकालीन विषाक्तता दिसून आली. विषारी परिणामांमुळे उच्च मृत्युदर दिसून आला, जो मायक्रोन्यूक्ली आणि एरिथ्रोसाइट न्यूक्लियर असामान्यता, विशेषतः सेरेटेड न्यूक्ली, लोब्ड न्यूक्ली आणि वेसिक्युलर न्यूक्ली यांच्या उपस्थितीमुळे दिसून आला. याव्यतिरिक्त, अभ्यास केलेल्या प्रजातींमध्ये तीव्र आणि दीर्घकालीन दोन्ही प्रकारचे पर्यावरणीय धोके वाढले. आमच्या संशोधन गटाच्या मागील अभ्यासांसह एकत्रित केलेल्या या डेटावरून असे दिसून आले की सायपरमेथ्रिनच्या वेगवेगळ्या व्यावसायिक सूत्रीकरणामुळे देखील एसिटाइलकोलिनेस्टेरेस (AChE) आणि ब्युटायरिलकोलिनेस्टेरेस (BChE) क्रियाकलाप आणि ऑक्सिडेटिव्ह ताण कमी झाला58, आणि परिणामी पी. ग्रॅसिलिसमध्ये पोहण्याच्या क्रियाकलाप आणि तोंडी विकृतींमध्ये बदल झाला59, जे दर्शविते की सायपरमेथ्रिनच्या व्यावसायिक सूत्रीकरणात या प्रजातीसाठी उच्च प्राणघातक आणि सबलेथल विषाक्तता आहे. हार्टमन आणि इतर 60 यांना आढळले की सायपरमेथ्रिनचे व्यावसायिक सूत्रीकरण पी. ग्रॅसिलिस आणि त्याच वंशाच्या दुसऱ्या प्रजाती (P. cuvieri) साठी नऊ इतर कीटकनाशकांच्या तुलनेत सर्वात विषारी होते. यावरून असे सूचित होते की पर्यावरण संरक्षणासाठी सायपरमेथ्रिनच्या कायदेशीररित्या मंजूर केलेल्या सांद्रतेमुळे उच्च मृत्युदर आणि दीर्घकालीन लोकसंख्या घट होऊ शकते.
उभयचर प्राण्यांसाठी या कीटकनाशकाची विषारीता किती आहे याचे मूल्यांकन करण्यासाठी पुढील अभ्यास आवश्यक आहेत, कारण वातावरणात आढळणाऱ्या सांद्रतेमुळे उच्च मृत्युदर होऊ शकतो आणि पी. ग्रॅसिलिससाठी संभाव्य धोका निर्माण होऊ शकतो. उभयचर प्रजातींवरील संशोधनाला प्रोत्साहन दिले पाहिजे, कारण या जीवांवरील डेटा दुर्मिळ आहे, विशेषतः ब्राझिलियन प्रजातींवरील.
स्थिर परिस्थितीत ही दीर्घकालीन विषारीता चाचणी १६८ तास (७ दिवस) चालली आणि त्यातील सबलेथल सांद्रता १, ३, ६ आणि २० μg ai L−१ होती. दोन्ही प्रयोगांमध्ये, प्रत्येक उपचार गटातील १० टॅडपोलचे सहा प्रतिकृतींसह मूल्यांकन करण्यात आले, ज्यामुळे प्रति एकाग्रतेमध्ये एकूण ६० टॅडपोल मिळाले. दरम्यान, फक्त पाण्यावर आधारित उपचार हे नकारात्मक नियंत्रण म्हणून काम करत होते. प्रत्येक प्रायोगिक सेटअपमध्ये ५०० मिली क्षमतेची आणि ५० मिली द्रावणात १ टॅडपोलची घनता असलेली निर्जंतुक काचेची डिश होती. बाष्पीभवन रोखण्यासाठी फ्लास्क पॉलिथिलीन फिल्मने झाकलेला होता आणि सतत वायूवित केला जात होता.
०, ९६ आणि १६८ तासांवर कीटकनाशकांचे प्रमाण निश्चित करण्यासाठी पाण्याचे रासायनिक विश्लेषण करण्यात आले. सबीन एट अल. ६८ आणि मार्टिन्स एट अल. ६९ यांच्या मते, सांता मारियाच्या फेडरल युनिव्हर्सिटीच्या कीटकनाशक विश्लेषण प्रयोगशाळेत (LARP) ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमेट्री (व्हेरियन मॉडेल १२००, पालो अल्टो, कॅलिफोर्निया, यूएसए) गॅस क्रोमॅटोग्राफी वापरून विश्लेषण केले गेले. पाण्यातील कीटकनाशकांचे परिमाणात्मक निर्धारण पूरक सामग्री म्हणून दर्शविले आहे (टेबल SM1).
मायक्रोन्यूक्लियस चाचणी (MNT) आणि रेड सेल न्यूक्लियर असामान्यता चाचणी (RNA) साठी, प्रत्येक उपचार गटातील 15 टॅडपोलचे विश्लेषण करण्यात आले. टॅडपोलना 5% लिडोकेन (50 mg g-170) ने भूल देण्यात आली आणि डिस्पोजेबल हेपरिनाइज्ड सिरिंज वापरून कार्डियाक पंचरद्वारे रक्ताचे नमुने गोळा करण्यात आले. निर्जंतुकीकरण सूक्ष्मदर्शक स्लाईड्सवर रक्ताचे स्मीअर तयार करण्यात आले, हवेत वाळवले गेले, 100% मिथेनॉल (4 °C) सह 2 मिनिटांसाठी स्थिर केले गेले आणि नंतर अंधारात 15 मिनिटे 10% गिएम्सा द्रावणाने रंगवले गेले. प्रक्रियेच्या शेवटी, अतिरिक्त डाग काढून टाकण्यासाठी स्लाईड्स डिस्टिल्ड पाण्याने धुतल्या गेल्या आणि खोलीच्या तपमानावर वाळवल्या गेल्या.
प्रत्येक टॅडपोलमधील किमान १००० लाल रक्तपेशींचे १००× सूक्ष्मदर्शक वापरून विश्लेषण करण्यात आले ज्याचा उद्देश ७१ होता. सायपरमेथ्रिन सांद्रता आणि नियंत्रणे लक्षात घेऊन टॅडपोलमधील एकूण ७५,७९६ लाल रक्तपेशींचे मूल्यांकन करण्यात आले. कॅरास्को आणि फेनेच आणि इतर ३८,७२ च्या पद्धतीनुसार खालील न्यूक्लियर जखमांची वारंवारता निश्चित करून जीनोटॉक्सिसिटीचे विश्लेषण करण्यात आले: (१) एन्युक्लीएट पेशी: न्यूक्लियर नसलेल्या पेशी; (२) अपोप्टोटिक पेशी: न्यूक्लियर फ्रॅगमेंटेशन, प्रोग्राम केलेले सेल डेथ; (३) बायन्युक्लीएट पेशी: दोन न्यूक्लियर असलेल्या पेशी; (४) न्यूक्लियर बड्स किंवा ब्लेब पेशी: न्यूक्लियर झिल्लीच्या लहान प्रोट्र्यूशन्ससह न्यूक्लियर असलेल्या पेशी, मायक्रोन्यूक्लीइच्या आकारात सारखे ब्लेब; (५) कॅरियोलाइज्ड पेशी: अंतर्गत सामग्रीशिवाय न्यूक्लियरची बाह्यरेखा असलेल्या पेशी; (६) खाच असलेल्या पेशी: स्पष्ट क्रॅक किंवा खाच असलेल्या न्यूक्लियर असलेल्या पेशी, ज्याला मूत्रपिंडाच्या आकाराचे केंद्रक देखील म्हणतात; (७) लोब्युलेटेड पेशी: वर उल्लेख केलेल्या वेसिकल्सपेक्षा मोठे न्यूक्लियर प्रोट्र्यूशन्स असलेल्या पेशी; आणि (८) सूक्ष्म पेशी: घनरूप केंद्रक आणि कमी सायटोप्लाझम असलेल्या पेशी. बदलांची तुलना नकारात्मक नियंत्रण परिणामांशी करण्यात आली.
तीव्र विषारीपणा चाचणी निकालांचे (LC50) विश्लेषण GBasic सॉफ्टवेअर आणि TSK-ट्रिम्ड स्पीअरमन-कार्बर पद्धत74 वापरून करण्यात आले. क्रॉनिक चाचणी डेटाची त्रुटी सामान्यता (शापिरो-विल्क्स) आणि भिन्नतेची एकरूपता (बार्टलेट) साठी पूर्व-चाचणी करण्यात आली. भिन्नतेचे एकतर्फी विश्लेषण (ANOVA) वापरून निकालांचे विश्लेषण करण्यात आले. तुकीची चाचणी आपापसात डेटाची तुलना करण्यासाठी वापरली गेली आणि डनेटची चाचणी उपचार गट आणि नकारात्मक नियंत्रण गटातील डेटाची तुलना करण्यासाठी वापरली गेली.
डनेटच्या चाचणीचा वापर करून LOEC आणि NOEC डेटाचे विश्लेषण करण्यात आले. स्टॅटिस्टिका 8.0 सॉफ्टवेअर (स्टॅटसॉफ्ट) वापरून सांख्यिकीय चाचण्या 95% (p < 0.05) च्या महत्त्व पातळीसह केल्या गेल्या.