शूट एपिकल मेरिस्टेममध्ये इंटरनोड स्पेसिफिकेशनमध्ये गिबेरेलिनची भूमिका क्वांटिटेटिव्ह गिबेरेलिन बायोसेन्सरने उघड केली.

देठाच्या रचनेसाठी शूट एपिकल मेरिस्टेम (SAM) वाढ अत्यंत महत्त्वाची आहे. वनस्पती संप्रेरकेगिब्बेरेलिन(GAs) वनस्पतींच्या वाढीचे समन्वय साधण्यात महत्त्वाची भूमिका बजावतात, परंतु SAM मध्ये त्यांची भूमिका अद्याप समजलेली नाही. येथे, आम्ही GA सिग्नलिंगचा एक रेशोमेट्रिक बायोसेन्सर विकसित केला आहे जो DELLA प्रोटीनचे अभियांत्रिकी करून GA ट्रान्सक्रिप्शनल प्रतिसादात त्याचे आवश्यक नियामक कार्य दाबतो आणि GA ओळखल्यानंतर त्याचे क्षय राखतो. आम्ही दाखवतो की हा क्षय-आधारित बायोसेन्सर विकासादरम्यान GA पातळी आणि सेल्युलर सेन्सिंगमधील बदल अचूकपणे रेकॉर्ड करतो. आम्ही SAM मध्ये GA सिग्नलिंग क्रियाकलाप मॅप करण्यासाठी या बायोसेन्सरचा वापर केला. आम्ही दाखवतो की उच्च GA सिग्नल प्रामुख्याने ऑर्गन प्राइमोर्डिया दरम्यान असलेल्या पेशींमध्ये असतात, जे इंटरनोड पेशींचे पूर्वसूचक असतात. गेन- आणि लॉस-ऑफ-फंक्शन दृष्टिकोन वापरून, आम्ही पुढे दाखवतो की GA सेल डिव्हिजन प्लेनच्या ओरिएंटेशनचे नियमन करतो, इंटरनोड्सचे कॅनोनिकल सेल्युलर ऑर्गनायझेशन स्थापित करतो, ज्यामुळे SAM मध्ये इंटरनोड स्पेसिफिकेशनला प्रोत्साहन मिळते.
अंकुराच्या शिखरावर स्थित असलेल्या अंकुराच्या शिखर मेरिस्टेम (SAM) मध्ये स्टेम पेशींचा एक कोनाडा असतो ज्यांची क्रिया वनस्पतीच्या संपूर्ण आयुष्यात मॉड्यूलर आणि पुनरावृत्ती पद्धतीने पार्श्व अवयव आणि स्टेम नोड्स निर्माण करते. या प्रत्येक पुनरावृत्ती युनिट्स किंवा वनस्पती नोड्समध्ये नोड्सवरील इंटरनोड्स आणि पार्श्व अवयव आणि पानांच्या अक्षांमध्ये अक्षीय मेरिस्टेम्स समाविष्ट असतात1. विकासादरम्यान वनस्पती नोड्सची वाढ आणि संघटना बदलते. अरेबिडोप्सिसमध्ये, वनस्पतिवत् होण्याच्या अवस्थेत इंटरनोडल वाढ दबली जाते आणि रोझेट पानांच्या अक्षांमध्ये अक्षीय मेरिस्टेम्स सुप्त राहतात. फुलांच्या टप्प्यात संक्रमणादरम्यान, SAM फुलणे मेरिस्टेम बनते, ज्यामुळे लांबलचक इंटरनोड्स आणि अक्षीय कळ्या, कौलिन पानांच्या अक्षांमध्ये फांद्या आणि नंतर, पाने नसलेली फुले निर्माण होतात2. जरी आपण पाने, फुले आणि फांद्यांच्या आरंभ नियंत्रित करणाऱ्या यंत्रणा समजून घेण्यात लक्षणीय प्रगती केली असली तरी, इंटरनोड्स कसे उद्भवतात याबद्दल तुलनेने कमी माहिती आहे.
GA चे स्पॅटिओटेम्पोरल वितरण समजून घेतल्याने वेगवेगळ्या ऊतींमध्ये आणि वेगवेगळ्या विकास टप्प्यांवर या संप्रेरकांचे कार्य अधिक चांगल्या प्रकारे समजून घेण्यास मदत होईल. त्याच्या स्वतःच्या प्रवर्तकाच्या कृती अंतर्गत व्यक्त केलेल्या RGA-GFP फ्यूजनच्या ऱ्हासाचे दृश्यमानीकरण मुळांमध्ये एकूण GA पातळीच्या नियमनाबद्दल महत्त्वाची माहिती प्रदान करते15,16. तथापि, RGA अभिव्यक्ती ऊतींमध्ये बदलते17 आणि GA18 द्वारे नियंत्रित केली जाते. अशा प्रकारे, RGA प्रवर्तकाच्या विभेदक अभिव्यक्तीमुळे RGA-GFP सह निरीक्षण केलेल्या फ्लोरोसेन्स पॅटर्नमध्ये परिणाम होऊ शकतो आणि अशा प्रकारे ही पद्धत परिमाणात्मक नाही. अलिकडेच, बायोएक्टिव्ह फ्लोरोसेसिन (Fl)-लेबल केलेल्या GA19,20 ने रूट एंडोकॉर्टेक्समध्ये GA चे संचय आणि GA ट्रान्सपोर्टद्वारे त्याच्या सेल्युलर पातळीचे नियमन उघड केले. अलीकडेच, GA FRET सेन्सर nlsGPS1 ने दाखवून दिले की GA पातळी मुळांमध्ये, तंतूंमध्ये आणि गडद वाढलेल्या हायपोकोटायल्समध्ये पेशींच्या लांबीशी संबंधित आहे21. तथापि, आपण पाहिल्याप्रमाणे, GA सांद्रता ही GA सिग्नलिंग क्रियाकलाप नियंत्रित करणारी एकमेव पॅरामीटर नाही, कारण ती जटिल संवेदन प्रक्रियांवर अवलंबून असते. येथे, DELLA आणि GA सिग्नलिंग मार्गांबद्दलच्या आमच्या समजुतीवर आधारित, आम्ही GA सिग्नलिंगसाठी डिग्रेडेशन-आधारित रेशियोमेट्रिक बायोसेन्सरच्या विकासाचा आणि वैशिष्ट्यीकरणाचा अहवाल देतो. हे परिमाणात्मक बायोसेन्सर विकसित करण्यासाठी, आम्ही एक उत्परिवर्ती GA-संवेदनशील RGA वापरला जो फ्लोरोसेंट प्रथिनाशी जोडलेला होता आणि ऊतींमध्ये सर्वव्यापीपणे व्यक्त केला जात होता, तसेच GA-असंवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रथिन देखील वापरला. आम्ही दाखवतो की उत्परिवर्ती RGA प्रोटीन फ्यूजन सर्वव्यापीपणे व्यक्त केल्यावर अंतर्जात GA सिग्नलिंगमध्ये व्यत्यय आणत नाहीत आणि हे बायोसेन्सर उच्च स्पॅटिओटेम्पोरल रिझोल्यूशनसह सेन्सिंग उपकरणाद्वारे GA इनपुट आणि GA सिग्नल प्रक्रियेमुळे उद्भवणाऱ्या सिग्नलिंग क्रियाकलापांचे प्रमाण मोजू शकतो. आम्ही या बायोसेन्सरचा वापर GA सिग्नलिंग क्रियाकलापांच्या स्पॅटिओटेम्पोरल वितरणाचे मॅप करण्यासाठी आणि GA SAM एपिडर्मिसमध्ये सेल्युलर वर्तनाचे नियमन कसे करते हे मोजण्यासाठी केला. आम्ही दाखवतो की GA ऑर्गन प्राइमोर्डिया दरम्यान स्थित SAM पेशींच्या डिव्हिजन प्लेनच्या ओरिएंटेशनचे नियमन करतो, ज्यामुळे इंटरनोडची कॅनोनिकल सेल्युलर संघटना परिभाषित होते.
शेवटी, आम्ही विचारले की वाढत्या हायपोकोटाइलचा वापर करून qmRGA अंतर्जात GA पातळीतील बदल नोंदवू शकते का. आम्ही पूर्वी दाखवले होते की नायट्रेट GA संश्लेषण वाढवून आणि त्या बदल्यात, DELLA34 क्षय करून वाढीस उत्तेजन देते. त्यानुसार, आम्ही निरीक्षण केले की मुबलक नायट्रेट पुरवठ्याखाली (१० mM NO3−) वाढवलेल्या pUBQ10::qmRGA रोपांमध्ये हायपोकोटाइलची लांबी नायट्रेट-कमतरतेच्या परिस्थितीत वाढवलेल्या रोपांपेक्षा लक्षणीयरीत्या जास्त होती (पूरक आकृती ६अ). वाढीच्या प्रतिसादाशी सुसंगत, नायट्रेटच्या अनुपस्थितीत वाढवलेल्या रोपांपेक्षा १० mM NO3− परिस्थितीत वाढवलेल्या रोपांच्या हायपोकोटाइलमध्ये GA सिग्नल जास्त होते (पूरक आकृती ६ब, क). अशाप्रकारे, qmRGA GA एकाग्रतेतील अंतर्जात बदलांमुळे GA सिग्नलिंगमधील बदलांचे निरीक्षण करण्यास देखील सक्षम करते.
सेन्सर डिझाइनच्या आधारे अपेक्षेप्रमाणे, qmRGA द्वारे शोधलेली GA सिग्नलिंग क्रियाकलाप GA एकाग्रता आणि GA धारणा यावर अवलंबून आहे की नाही हे समजून घेण्यासाठी, आम्ही वनस्पति आणि पुनरुत्पादक ऊतींमधील तीन GID1 रिसेप्टर्सच्या अभिव्यक्तीचे विश्लेषण केले. रोपांमध्ये, GID1-GUS रिपोर्टर लाइनने दर्शविले की GID1a आणि c हे कोटिलेडॉनमध्ये उच्च प्रमाणात व्यक्त केले गेले होते (आकृती 3a–c). याव्यतिरिक्त, तिन्ही रिसेप्टर्स पाने, पार्श्व मूळ प्राइमॉर्डिया, मुळांच्या टोकांमध्ये (GID1b च्या मूळ टोपी वगळता) आणि रक्तवहिन्यासंबंधी प्रणालीमध्ये व्यक्त केले गेले होते (आकृती 3a–c). फुलणे SAM मध्ये, आम्हाला फक्त GID1b आणि 1c साठी GUS सिग्नल आढळले (पूरक आकृती 7a–c). इन सिटू हायब्रिडायझेशनने या अभिव्यक्ती नमुन्यांची पुष्टी केली आणि पुढे असे सिद्ध केले की GID1c SAM मध्ये कमी पातळीवर एकसमानपणे व्यक्त केले गेले होते, तर GID1b ने SAM च्या परिघावर उच्च अभिव्यक्ती दर्शविली (पूरक आकृती 7d–l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b ट्रान्सलेशनल फ्यूजनने GID1b अभिव्यक्तीची श्रेणीबद्ध श्रेणी देखील उघड केली, SAM च्या मध्यभागी कमी किंवा शून्य अभिव्यक्तीपासून ते अवयव सीमांवर उच्च अभिव्यक्तीपर्यंत (पूरक आकृती 7m). अशाप्रकारे, GID1 रिसेप्टर्स ऊतींमध्ये आणि आत एकसमानपणे वितरित केले जात नाहीत. त्यानंतरच्या प्रयोगांमध्ये, आम्हाला असेही आढळून आले की GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) च्या अतिअभिव्यक्तीने बाह्य GA अनुप्रयोगासाठी हायपोकोटाइलमध्ये qmRGA ची संवेदनशीलता वाढवली (आकृती 3d, e). याउलट, हायपोकोटाइलमध्ये qd17mRGA द्वारे मोजलेले फ्लोरोसेन्स GA3 उपचारांसाठी असंवेदनशील होते (आकृती 3f, g). दोन्ही चाचण्यांसाठी, सेन्सरच्या जलद वर्तनाचे मूल्यांकन करण्यासाठी रोपांवर GA (100 μM GA3) च्या उच्च सांद्रतेसह उपचार केले गेले, जिथे GID1 रिसेप्टरशी बांधण्याची क्षमता वाढली किंवा गमावली गेली. एकत्रितपणे, हे निकाल पुष्टी करतात की qmRGA बायोसेन्सर GA आणि GA सेन्सर म्हणून एकत्रित कार्य करतो आणि सूचित करतो की GID1 रिसेप्टरची विभेदक अभिव्यक्ती सेन्सरच्या उत्सर्जनशीलतेमध्ये लक्षणीय बदल करू शकते.
आजपर्यंत, SAM मध्ये GA सिग्नलचे वितरण अस्पष्ट राहिले आहे. म्हणून, आम्ही GA सिग्नलिंग क्रियाकलापांचे उच्च-रिझोल्यूशन परिमाणात्मक नकाशे मोजण्यासाठी qmRGA-अभिव्यक्त करणारे वनस्पती आणि pCLV3::mCherry-NLS स्टेम सेल रिपोर्टर35 वापरले, L1 थरावर लक्ष केंद्रित करून (एपिडर्मिस; आकृती 4a, b, पद्धती आणि पूरक पद्धती पहा), कारण L1 SAM वाढ नियंत्रित करण्यात महत्त्वाची भूमिका बजावते36. येथे, pCLV3::mCherry-NLS अभिव्यक्तीने GA सिग्नलिंग क्रियाकलापांच्या अवकाशीय-काळाच्या वितरणाचे विश्लेषण करण्यासाठी एक निश्चित भौमितिक संदर्भ बिंदू प्रदान केला37. जरी GA ला पार्श्व अवयव विकासासाठी आवश्यक मानले जात असले तरी, आम्ही असे पाहिले की P3 टप्प्यापासून सुरू होणाऱ्या फुलांच्या प्रिमॉर्डियम (P) मध्ये GA सिग्नल कमी होते (आकृती 4a, b), तर तरुण P1 आणि P2 प्रिमॉर्डियममध्ये मध्यवर्ती प्रदेशासारखीच मध्यम क्रियाकलाप होती (आकृती 4a, b). ऑर्गन प्रिमॉर्डियम सीमांवर उच्च GA सिग्नलिंग क्रियाकलाप आढळून आला, जो P1/P2 पासून सुरू होऊन (सीमेच्या बाजूने) P4 वर पोहोचला, तसेच प्रिमॉर्डिया दरम्यान स्थित परिधीय प्रदेशातील सर्व पेशींमध्ये आढळला (आकृती 4a, b आणि पूरक आकृती 8a, b). ही उच्च GA सिग्नलिंग क्रियाकलाप केवळ एपिडर्मिसमध्येच नव्हे तर L2 आणि वरच्या L3 थरांमध्ये देखील दिसून आली (पूरक आकृती 8b). qmRGA वापरून SAM मध्ये आढळलेल्या GA सिग्नलचा नमुना देखील कालांतराने अपरिवर्तित राहिला (पूरक आकृती 8c–f, k). जरी आम्ही तपशीलवार वर्णन केलेल्या पाच स्वतंत्र रेषांमधून T3 वनस्पतींच्या SAM मध्ये qd17mRGA रचना पद्धतशीरपणे कमी केली गेली असली तरी, आम्ही pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP रचना (पूरक आकृती 8g–j, l) सह प्राप्त झालेल्या फ्लोरोसेन्स नमुन्यांचे विश्लेषण करू शकलो. या नियंत्रण रेषेत, SAM मध्ये फ्लोरोसेन्स रेशोमध्ये फक्त किरकोळ बदल आढळले, परंतु SAM केंद्रात आम्हाला TagBFP शी संबंधित VENUS मध्ये स्पष्ट आणि अनपेक्षित घट दिसून आली. हे पुष्टी करते की qmRGA द्वारे पाहिलेला सिग्नलिंग पॅटर्न mRGA-VENUS च्या GA-आश्रित क्षय प्रतिबिंबित करतो, परंतु हे देखील दर्शवितो की qmRGA मेरिस्टेम सेंटरमध्ये GA सिग्नलिंग क्रियाकलापांना जास्त अंदाज लावू शकतो. थोडक्यात, आमचे निकाल GA सिग्नलिंग पॅटर्न प्रकट करतात जे प्रामुख्याने प्राइमोर्डियाचे वितरण प्रतिबिंबित करतात. इंटर-प्राइमोर्डियल प्रदेश (IPR) चे हे वितरण विकसनशील प्राइमोर्डियम आणि मध्य प्रदेश दरम्यान उच्च GA सिग्नलिंग क्रियाकलापांच्या हळूहळू स्थापनेमुळे होते, तर त्याच वेळी प्राइमोर्डियममध्ये GA सिग्नलिंग क्रियाकलाप कमी होतो (आकृती 4c, d).
GID1b आणि GID1c रिसेप्टर्सचे वितरण (वर पहा) असे सूचित करते की GA रिसेप्टर्सची विभेदक अभिव्यक्ती SAM मध्ये GA सिग्नलिंग क्रियाकलापांच्या पॅटर्नला आकार देण्यास मदत करते. आम्हाला आश्चर्य वाटले की GA चे विभेदक संचय यात सामील असू शकते का. या शक्यतेची तपासणी करण्यासाठी, आम्ही nlsGPS1 GA FRET सेन्सर21 वापरला. 100 मिनिटांसाठी 10 μM GA4+7 सह उपचार केलेल्या nlsGPS1 च्या SAM मध्ये वाढलेली सक्रियता वारंवारता आढळली (पूरक आकृती 9a–e), जे दर्शवते की nlsGPS1 SAM मध्ये GA एकाग्रतेतील बदलांना प्रतिसाद देते, जसे ते मुळांमध्ये करते21. nlsGPS1 सक्रियता वारंवारतेच्या स्थानिक वितरणाने SAM च्या बाह्य थरांमध्ये तुलनेने कमी GA पातळी दर्शविली, परंतु ते मध्यभागी आणि SAM च्या सीमेवर उंचावलेले असल्याचे दर्शविले (आकृती 4e आणि पूरक आकृती 9a,c). हे सूचित करते की GA देखील SAM मध्ये qmRGA द्वारे प्रकट केलेल्या अवकाशीय पॅटर्नसह वितरित केले जाते. पूरक दृष्टिकोन म्हणून, आम्ही फ्लोरोसेंट GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) किंवा फक्त Fl सह SAM ला नकारात्मक नियंत्रण म्हणून देखील हाताळले. Fl सिग्नल संपूर्ण SAM मध्ये वितरित केला गेला, ज्यामध्ये मध्यवर्ती प्रदेश आणि प्रिमॉर्डियमचा समावेश होता, जरी कमी तीव्रतेवर (आकृती 4j आणि पूरक आकृती 10d). याउलट, तिन्ही GA-Fl विशेषतः प्रिमॉर्डियमच्या सीमांमध्ये आणि उर्वरित IPR मध्ये वेगवेगळ्या प्रमाणात जमा झाले, GA7-Fl IPR मधील सर्वात मोठ्या डोमेनमध्ये जमा झाले (आकृती 4k आणि पूरक आकृती 10a,b). फ्लोरोसन्स तीव्रतेच्या परिमाणावरून असे दिसून आले की Fl-उपचारित SAM (आकृती 4l आणि पूरक आकृती 10c) च्या तुलनेत GA-Fl-उपचारित SAM मध्ये IPR ते नॉन-IPR तीव्रता गुणोत्तर जास्त होते. एकत्रितपणे, हे परिणाम सूचित करतात की GA अवयव सीमेच्या सर्वात जवळ असलेल्या IPR पेशींमध्ये जास्त सांद्रतेवर उपस्थित आहे. यावरून असे सूचित होते की SAM GA सिग्नलिंग क्रियाकलापांचा नमुना GA रिसेप्टर्सच्या विभेदक अभिव्यक्ती आणि अवयवांच्या सीमांजवळील IPR पेशींमध्ये GA च्या विभेदक संचयनामुळे होतो. अशाप्रकारे, आमच्या विश्लेषणातून GA सिग्नलिंगचा एक अनपेक्षित अवकाशीय नमुना उघड झाला, ज्यामध्ये SAM च्या मध्यभागी आणि प्राथमिक भागात कमी क्रियाकलाप आणि परिधीय प्रदेशात IPR मध्ये उच्च क्रियाकलाप होता.
SAM मध्ये विभेदक GA सिग्नलिंग क्रियाकलापाची भूमिका समजून घेण्यासाठी, आम्ही SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS च्या रिअल-टाइम टाइम-लॅप्स इमेजिंगचा वापर करून GA सिग्नलिंग क्रियाकलाप, पेशी विस्तार आणि पेशी विभाजन यांच्यातील सहसंबंधांचे विश्लेषण केले. वाढीच्या नियमनात GA ची भूमिका पाहता, पेशी विस्तार पॅरामीटर्ससह सकारात्मक सहसंबंध अपेक्षित होता. म्हणून, आम्ही प्रथम GA सिग्नलिंग क्रियाकलाप नकाशांची तुलना पेशी पृष्ठभागाच्या वाढीच्या दराच्या नकाशांशी केली (दिलेल्या पेशीसाठी आणि विभाजनाच्या वेळी मुली पेशींसाठी पेशी विस्ताराच्या ताकदीसाठी प्रॉक्सी म्हणून) आणि वाढीच्या अॅनिसोट्रॉपीच्या नकाशांशी केली, जी पेशी विस्ताराची दिशा मोजते (दिलेल्या पेशीसाठी आणि विभाजनाच्या वेळी मुली पेशींसाठी देखील येथे वापरले जाते; आकृती 5a, b, पद्धती आणि पूरक पद्धती पहा). SAM पेशी पृष्ठभागाच्या वाढीच्या दराचे आमचे नकाशे मागील निरीक्षणांशी सुसंगत आहेत38,39, सीमेवर किमान वाढ दर आणि विकसित होणाऱ्या फुलांमध्ये जास्तीत जास्त वाढ दर (आकृती 5a). प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA) ने दर्शविले की GA सिग्नलिंग क्रियाकलाप पेशी पृष्ठभागाच्या वाढीच्या तीव्रतेशी नकारात्मकरित्या सहसंबंधित होता (आकृती 5c). आम्ही हे देखील दाखवून दिले की GA सिग्नलिंग इनपुट आणि वाढीची तीव्रता यासह भिन्नतेचे मुख्य अक्ष उच्च CLV3 अभिव्यक्तीद्वारे निर्धारित केलेल्या दिशेने ऑर्थोगोनल होते, ज्यामुळे उर्वरित विश्लेषणांमध्ये SAM केंद्रातून पेशी वगळल्याची पुष्टी होते. स्पीअरमन सहसंबंध विश्लेषणाने PCA निकालांची पुष्टी केली (आकृती 5d), असे दर्शविते की IPR मध्ये उच्च GA सिग्नलमुळे उच्च पेशी विस्तार झाला नाही. तथापि, सहसंबंध विश्लेषणाने GA सिग्नलिंग क्रियाकलाप आणि वाढ अॅनिसोट्रॉपी (आकृती 5c, d) यांच्यात थोडासा सकारात्मक सहसंबंध उघड केला, जो सूचित करतो की IPR मध्ये उच्च GA सिग्नलिंग पेशींच्या वाढीच्या दिशेने आणि शक्यतो पेशी विभाजन समतलाच्या स्थितीवर प्रभाव पाडते.
a, b SAM मध्ये सरासरी पृष्ठभागाच्या वाढीचे (a) आणि वाढीचे अॅनिसोट्रॉपी (b) उष्णतेचे नकाशे सरासरी सात स्वतंत्र वनस्पतींपेक्षा जास्त होते (अनुक्रमे पेशींच्या विस्ताराची ताकद आणि दिशा यासाठी प्रॉक्सी म्हणून वापरले जाते). c PCA विश्लेषणात खालील चल समाविष्ट होते: GA सिग्नल, पृष्ठभागाच्या वाढीची तीव्रता, पृष्ठभागाच्या वाढीचे अॅनिसोट्रॉपी आणि CLV3 अभिव्यक्ती. PCA घटक 1 प्रामुख्याने पृष्ठभागाच्या वाढीच्या तीव्रतेशी नकारात्मकरित्या सहसंबंधित होता आणि GA सिग्नलशी सकारात्मकरित्या सहसंबंधित होता. PCA घटक 2 प्रामुख्याने पृष्ठभागाच्या वाढीचे अॅनिसोट्रॉपीशी सकारात्मकरित्या सहसंबंधित होता आणि CLV3 अभिव्यक्तीशी नकारात्मकरित्या सहसंबंधित होता. टक्केवारी प्रत्येक घटकाद्वारे स्पष्ट केलेल्या भिन्नतेचे प्रतिनिधित्व करते. d CZ वगळता ऊतींच्या प्रमाणात GA सिग्नल, पृष्ठभागाच्या वाढीची तीव्रता आणि पृष्ठभागाच्या वाढीचे अॅनिसोट्रॉपी दरम्यान स्पियरमन सहसंबंध विश्लेषण. उजवीकडील संख्या दोन चलांमधील स्पियरमन rho मूल्य आहे. तारका अशा प्रकरणांना सूचित करतात जिथे सहसंबंध/नकारात्मक सहसंबंध अत्यंत महत्त्वपूर्ण आहे. e कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपीद्वारे Col-0 SAM L1 पेशींचे 3D व्हिज्युअलायझेशन. १० तासांवर SAM मध्ये (पण प्रिमॉर्डियम नाही) तयार झालेल्या नवीन पेशी भिंती त्यांच्या कोन मूल्यांनुसार रंगवल्या जातात. रंग पट्टी खालच्या उजव्या कोपऱ्यात दाखवली आहे. इनसेट ० तासांवर संबंधित ३D प्रतिमा दाखवते. प्रयोगाची पुनरावृत्ती दोनदा झाली आणि समान परिणाम मिळाले. f बॉक्स प्लॉट IPR आणि नॉन-IPR स्तंभ-० SAM (n = १० स्वतंत्र वनस्पती) मध्ये पेशी विभाजन दर दर्शवतात. मध्य रेषा मध्यक दर्शवते आणि बॉक्स सीमा २५ व्या आणि ७५ व्या पर्सेंटाइल दर्शवतात. व्हिस्कर्स R सॉफ्टवेअरसह निर्धारित किमान आणि कमाल मूल्ये दर्शवतात. वेल्चच्या दोन-पुच्छ टी-चाचणीने P मूल्ये मिळवली गेली. g, h योजनाबद्ध आकृती (g) SAM च्या केंद्रापासून रेडियल दिशेच्या संदर्भात नवीन पेशी भिंतीचा (मॅजेन्टा) कोन कसा मोजायचा हे दर्शविते (पांढरी ठिपकेदार रेषा) (फक्त तीव्र कोन मूल्ये, म्हणजेच ०-९०°, विचारात घेतली जातात), आणि (h) मेरिस्टेममधील परिघीय/पार्श्व आणि रेडियल दिशानिर्देश. i अनुक्रमे SAM (गडद निळा), IPR (मध्यम निळा) आणि नॉन-IPR (हलका निळा) वर पेशी विभाजन समतल अभिमुखतेचे वारंवारता हिस्टोग्राम. दोन-पुच्छ कोल्मोगोरोव्ह-स्मिर्नोव्ह चाचणीद्वारे P मूल्ये प्राप्त केली गेली. समान परिणामांसह प्रयोगाची दोनदा पुनरावृत्ती झाली. j अनुक्रमे P3 (हलका हिरवा), P4 (मध्यम हिरवा) आणि P5 (गडद हिरवा) भोवती IPR च्या पेशी विभाजन समतल अभिमुखतेचे वारंवारता हिस्टोग्राम. दोन-पुच्छ कोल्मोगोरोव्ह-स्मिर्नोव्ह चाचणीद्वारे P मूल्ये प्राप्त केली गेली. समान परिणामांसह प्रयोगाची दोनदा पुनरावृत्ती झाली.
म्हणून, आम्ही पुढे परख दरम्यान नवीन तयार झालेल्या पेशी भिंती ओळखून GA सिग्नलिंग आणि पेशी विभाजन क्रियाकलापांमधील सहसंबंध तपासला (आकृती 5e). या दृष्टिकोनामुळे आम्हाला पेशी विभाजनाची वारंवारता आणि दिशा मोजता आली. आश्चर्याची गोष्ट म्हणजे, आम्हाला आढळले की IPR आणि उर्वरित SAM (नॉन-IPR, आकृती 5f) मधील पेशी विभाजनांची वारंवारता समान होती, जे दर्शवते की IPR आणि नॉन-IPR पेशींमधील GA सिग्नलिंगमधील फरक पेशी विभाजनावर लक्षणीय परिणाम करत नाहीत. हे आणि GA सिग्नलिंग आणि वाढ अॅनिसोट्रॉपीमधील सकारात्मक सहसंबंध, आम्हाला GA सिग्नलिंग क्रियाकलाप पेशी विभाजन समतलाच्या अभिमुखतेवर प्रभाव टाकू शकतो का याचा विचार करण्यास प्रवृत्त केले. आम्ही मेरिस्टेम सेंटर आणि नवीन सेल भिंतीच्या मध्यभागी जोडणाऱ्या रेडियल अक्षाच्या सापेक्ष तीव्र कोन म्हणून नवीन सेल भिंतीचे अभिमुखीकरण मोजले (आकृती 5e-i) आणि पेशींमध्ये रेडियल अक्षाच्या सापेक्ष 90° च्या जवळच्या कोनात विभाजन होण्याची स्पष्ट प्रवृत्ती पाहिली, ज्यामध्ये सर्वाधिक फ्रिक्वेन्सी 70–80° (23.28%) आणि 80–90° (22.62%) (आकृती 5e,i) येथे आढळली, जी परिघीय/ट्रान्सव्हर्स दिशेने पेशी विभाजनांशी संबंधित होती (आकृती 5h). या सेल विभाजन वर्तनात GA सिग्नलिंगच्या योगदानाचे परीक्षण करण्यासाठी, आम्ही IPR आणि नॉन-IPR मधील पेशी विभाजन पॅरामीटर्सचे स्वतंत्रपणे विश्लेषण केले (आकृती 5i). आम्हाला आढळले की IPR पेशींमध्ये विभाजन कोन वितरण नॉन-IPR पेशींमध्ये किंवा संपूर्ण SAM मधील पेशींपेक्षा वेगळे होते, IPR पेशींमध्ये पार्श्व/वर्तुळाकार पेशी विभाजनांचे प्रमाण जास्त होते, म्हणजेच, 70-80° आणि 80-90° (अनुक्रमे 33.86% आणि 30.71%, संबंधित प्रमाण) (आकृती 5i). अशाप्रकारे, आमच्या निरीक्षणांमध्ये उच्च GA सिग्नलिंग आणि परिघीय दिशेच्या जवळ असलेल्या पेशी विभाजन समतल अभिमुखतेमधील संबंध आढळला, जो GA सिग्नलिंग क्रियाकलाप आणि वाढ अॅनिसोट्रॉपी (आकृती 5c, d) यांच्यातील सहसंबंधासारखा आहे. या संबंधाचे स्थानिक संवर्धन अधिक स्थापित करण्यासाठी, आम्ही P3 पासून सुरू होणाऱ्या प्रिमॉर्डियमभोवती असलेल्या IPR पेशींमध्ये विभाजन समतल अभिमुखता मोजली, कारण P4 पासून सुरू होणाऱ्या या प्रदेशात सर्वाधिक GA सिग्नलिंग क्रियाकलाप आढळून आला होता (आकृती 4). P3 आणि P4 च्या आसपासच्या IPR च्या विभाजन कोनांमध्ये कोणतेही सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण फरक दिसून आले नाहीत, जरी P4 च्या आसपास IPR मध्ये पार्श्व पेशी विभाजनांची वाढलेली वारंवारता दिसून आली (आकृती 5j). तथापि, P5 च्या आसपासच्या IPR पेशींमध्ये, पेशी विभाजन समतलाच्या अभिमुखतेतील फरक सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण बनला, ट्रान्सव्हर्स पेशी विभाजनांच्या वारंवारतेत तीव्र वाढ झाली (आकृती 5j). एकत्रितपणे, हे निकाल सूचित करतात की GA सिग्नलिंग SAM मधील पेशी विभाजनांच्या अभिमुखतेवर नियंत्रण ठेवू शकते, जे मागील अहवालांशी सुसंगत आहे40,41 की उच्च GA सिग्नलिंग IPR मध्ये पेशी विभाजनांच्या पार्श्व अभिमुखतेवर परिणाम करू शकते.
असा अंदाज आहे की IPR मधील पेशी प्राइमोर्डियामध्ये समाविष्ट केल्या जाणार नाहीत तर इंटरनोड्समध्ये समाविष्ट केल्या जातील2,42,43. IPR मधील पेशी विभाजनांच्या ट्रान्सव्हर्स ओरिएंटेशनमुळे इंटरनोड्समध्ये एपिडर्मल पेशींच्या समांतर रेखांशाच्या ओळींचे विशिष्ट संघटन होऊ शकते. वर वर्णन केलेल्या आमच्या निरीक्षणांवरून असे सूचित होते की GA सिग्नलिंग पेशी विभाजनाची दिशा नियंत्रित करून या प्रक्रियेत भूमिका बजावते.
अनेक DELLA जनुकांच्या कार्यक्षमतेचे नुकसान झाल्यामुळे GA प्रतिसाद निर्माण होतो आणि या गृहीतकाची चाचणी करण्यासाठी della उत्परिवर्तनांचा वापर केला जाऊ शकतो44. आम्ही प्रथम SAM मधील पाच DELLA जनुकांच्या अभिव्यक्ती नमुन्यांचे विश्लेषण केले. GUS लाइन45 च्या ट्रान्सक्रिप्शनल फ्यूजनवरून असे दिसून आले की GAI, RGA, RGL1 आणि RGL2 (खूप कमी प्रमाणात) SAM मध्ये व्यक्त केले गेले (पूरक आकृती 11a–d). इन सिटू हायब्रिडायझेशनने पुढे असे दर्शविले की GAI mRNA विशेषतः प्राइमोर्डिया आणि विकसनशील फुलांमध्ये जमा होते (पूरक आकृती 11e). RGL1 आणि RGL3 mRNA संपूर्ण SAM कॅनोपीमध्ये आणि जुन्या फुलांमध्ये आढळले, तर RGL2 mRNA सीमावर्ती प्रदेशात अधिक प्रमाणात आढळले (पूरक आकृती 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM च्या कॉन्फोकल इमेजिंगने इन सिटू हायब्रिडायझेशनद्वारे निरीक्षण केलेल्या अभिव्यक्तीची पुष्टी केली आणि दर्शविले की RGL3 प्रथिने SAM च्या मध्यवर्ती भागात जमा होतात (पूरक आकृती 11i). pRGA::GFP-RGA रेषेचा वापर करून, आम्हाला असेही आढळले की SAM मध्ये RGA प्रथिने जमा होतात, परंतु P4 पासून सुरू होणाऱ्या सीमेवर त्याची विपुलता कमी होते (पूरक आकृती 11j). उल्लेखनीय म्हणजे, RGL3 आणि RGA चे अभिव्यक्ती नमुने qmRGA (आकृती 4) द्वारे शोधल्याप्रमाणे, IPR मधील उच्च GA सिग्नलिंग क्रियाकलापांशी सुसंगत आहेत. शिवाय, हे डेटा सूचित करतात की सर्व DELLA SAM मध्ये व्यक्त केले जातात आणि त्यांची अभिव्यक्ती एकत्रितपणे संपूर्ण SAM मध्ये पसरते.
आम्ही पुढे वाइल्ड-टाइप SAM (Ler, नियंत्रण) आणि gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (जागतिक) उत्परिवर्तनांमध्ये पेशी विभाजन पॅरामीटर्सचे विश्लेषण केले (आकृती 6a, b). मनोरंजकपणे, आम्हाला वाइल्ड प्रकाराच्या तुलनेत della global mutant SAM मध्ये पेशी विभाजन कोन फ्रिक्वेन्सीच्या वितरणात सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण बदल दिसून आला (आकृती 6c). della global mutant मधील हा बदल 80-90° कोनांच्या वारंवारतेत वाढ (34.71% विरुद्ध 24.55%) आणि काही प्रमाणात, 70-80° कोनांच्या (23.78% विरुद्ध 20.18%) झाल्यामुळे झाला, म्हणजेच, ट्रान्सव्हर्स सेल डिव्हिजनशी संबंधित (आकृती 6c). नॉन-ट्रान्सव्हर्स डिव्हिजनची वारंवारता (0-60°) डेला ग्लोबल म्युटंटमध्ये देखील कमी होती (आकृती 6c). डेला ग्लोबल म्युटंटच्या SAM मध्ये ट्रान्सव्हर्स सेल डिव्हिजनची वारंवारता लक्षणीयरीत्या वाढली (आकृती 6b). डेला ग्लोबल म्युटंटमध्ये वाइल्ड प्रकाराच्या तुलनेत IPR मध्ये ट्रान्सव्हर्स सेल डिव्हिजनची वारंवारता देखील जास्त होती (आकृती 6d). IPR क्षेत्राबाहेर, वाइल्ड प्रकारात सेल डिव्हिजन कोनांचे अधिक एकसमान वितरण होते, तर डेला ग्लोबल म्युटंट IPR (आकृती 6e) सारखे टेंजेन्शियल डिव्हिजन पसंत करत असे. आम्ही GA2 ऑक्सिडेस (ga2ox) क्विंटुपल म्युटंट (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, आणि ga2ox6-2) च्या SAM मध्ये सेल डिव्हिजनची दिशा देखील मोजली, जी GA-निष्क्रिय म्युटंट पार्श्वभूमी आहे ज्यामध्ये GA जमा होते. GA पातळीत वाढ झाल्यामुळे, क्विंटुपल ga2ox उत्परिवर्तित फुलांचा SAM Col-0 पेक्षा मोठा होता (पूरक आकृती 12a, b), आणि Col-0 च्या तुलनेत, क्विंटुपल ga2ox SAM ने पेशी विभाजन कोनांचे वेगळे वितरण दर्शविले, कोन वारंवारता 50° वरून 90° पर्यंत वाढली, म्हणजेच पुन्हा स्पर्शिक विभागांना अनुकूलता दर्शविली (पूरक आकृती 12a–c). अशाप्रकारे, आम्ही दाखवतो की GA सिग्नलिंग आणि GA संचयनाचे घटक सक्रियकरण IPR आणि उर्वरित SAM मध्ये पार्श्व पेशी विभाजनांना प्रेरित करते.
a, b कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपी वापरून PI-स्टेन्ड Ler (a) आणि ग्लोबल डेला म्युटंट (b) SAM च्या L1 थराचे 3D व्हिज्युअलायझेशन. 10-तासांच्या कालावधीत SAM मध्ये (परंतु प्रिमॉर्डियम नाही) तयार झालेल्या नवीन पेशी भिंती त्यांच्या कोन मूल्यांनुसार दर्शविल्या जातात आणि रंगवल्या जातात. इनसेट 0 तासांवर SAM दर्शवितो. खालच्या उजव्या कोपऱ्यात रंग पट्टी प्रदर्शित केली आहे. (b) मधील बाण ग्लोबल डेला म्युटंटमधील संरेखित सेल फाइल्सच्या उदाहरणाकडे निर्देश करतो. समान परिणामांसह प्रयोग दोनदा पुनरावृत्ती झाला. ce संपूर्ण SAM (d), IPR (e), आणि नॉन-IPR (f) मध्ये Ler आणि ग्लोबल डेला दरम्यान सेल डिव्हिजन प्लेन ओरिएंटेशनच्या वारंवारता वितरणाची तुलना. दोन-पुच्छ कोल्मोगोरोव्ह-स्मिरनोव्ह चाचणी वापरून P मूल्ये प्राप्त केली गेली. f, g कोल्मोगोरोव्ह-1-VENUS (j) ट्रान्सजेनिक वनस्पतींच्या PI-स्टेन्ड SAM च्या कॉन्फोकल प्रतिमांचे 3D व्हिज्युअलायझेशन. पॅनेल (a, b) 10 तासांच्या आत SAM मध्ये तयार झालेल्या नवीन पेशी भिंती (पण प्राइमोर्डिया नाही) दर्शवितात. प्रयोगाची पुनरावृत्ती दोनदा करण्यात आली आणि समान परिणाम मिळाले. h–j संपूर्ण SAM (h), IPR (i) आणि नॉन-IPR (j) मध्ये स्थित पेशी विभाजन समतल अभिमुखतेच्या वारंवारता वितरणाची तुलना Col-0 आणि pCUC2::gai-1-VENUS वनस्पतींमधील. P मूल्ये दोन-पुच्छ कोल्मोगोरोव्ह-स्मिरनोव्ह चाचणी वापरून मिळवली गेली.
आम्ही पुढे विशेषतः IPR मध्ये GA सिग्नलिंग रोखण्याच्या परिणामाची चाचणी केली. यासाठी, आम्ही VENUS मध्ये (pCUC2::gai-1-VENUS रेषेत) एकत्रित केलेल्या प्रबळ नकारात्मक gai-1 प्रथिनाची अभिव्यक्ती चालविण्यासाठी cotyledon cup 2 (CUC2) प्रमोटरचा वापर केला. वाइल्ड-टाइप SAM मध्ये, CUC2 प्रमोटर P4 पासून सीमा पेशींसह SAM मधील बहुतेक IPR ची अभिव्यक्ती चालवितो आणि pCUC2::gai-1-VENUS वनस्पतींमध्ये समान विशिष्ट अभिव्यक्ती आढळली (खाली पहा). pCUC2::gai-1-VENUS वनस्पतींच्या SAM किंवा IPR मधील पेशी विभाजन कोनांचे वितरण जंगली प्रकारापेक्षा लक्षणीयरीत्या वेगळे नव्हते, जरी अनपेक्षितपणे आम्हाला आढळले की या वनस्पतींमध्ये IPR नसलेल्या पेशी 80-90° च्या उच्च वारंवारतेवर विभागल्या गेल्या आहेत (आकृती 6f-j).
असे सुचवण्यात आले आहे की पेशी विभाजनाची दिशा SAM च्या भूमितीवर अवलंबून असते, विशेषतः ऊतींच्या वक्रतेमुळे निर्माण होणाऱ्या तन्य ताणावर46. म्हणून आम्ही विचारले की डेला ग्लोबल म्युटंट आणि pCUC2::gai-1-VENUS वनस्पतींमध्ये SAM चा आकार बदलला होता का. पूर्वी नोंदवल्याप्रमाणे12, डेला ग्लोबल म्युटंट SAM चा आकार वाइल्ड प्रकारापेक्षा मोठा होता (पूरक आकृती 13a, b, d). CLV3 आणि STM RNA च्या इन सिटू हायब्रिडायझेशनने डेला म्युटंटमध्ये मेरिस्टेम विस्ताराची पुष्टी केली आणि पुढे स्टेम सेल निशाचा पार्श्व विस्तार दर्शविला (पूरक आकृती 13e, f, h, i). तथापि, दोन्ही जीनोटाइपमध्ये SAM वक्रता समान होती (पूरक आकृती 13k, m, n, p). वाइल्ड प्रकाराच्या तुलनेत वक्रतेत बदल न होता gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant मध्ये आकारात समान वाढ दिसून आली (पूरक आकृती 13c, d, g, j, l, o, p). della quadruple mutant मध्ये पेशी विभाजन अभिमुखतेची वारंवारता देखील प्रभावित झाली, परंतु della monolithic mutant पेक्षा कमी प्रमाणात (पूरक आकृती 12d–f). वक्रतेवर परिणाम नसतानाही, हा डोस प्रभाव सूचित करतो की डेला quadruple mutant मधील अवशिष्ट RGL3 क्रियाकलाप DELLA क्रियाकलापाच्या नुकसानामुळे पेशी विभाजन अभिमुखतेतील बदल मर्यादित करतो आणि पार्श्व पेशी विभाजनातील बदल SAM भूमितीतील बदलांऐवजी GA सिग्नलिंग क्रियाकलापातील बदलांच्या प्रतिसादात होतात. वर वर्णन केल्याप्रमाणे, CUC2 प्रमोटर P4 पासून सुरू होणाऱ्या SAM मध्ये IPR अभिव्यक्ती चालवतो (पूरक आकृती 14a, b), आणि त्याउलट, pCUC2::gai-1-VENUS SAM चा आकार कमी होता परंतु वक्रता जास्त होती (पूरक आकृती 14c–h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM आकारविज्ञानातील या बदलामुळे वाइल्ड प्रकाराच्या तुलनेत यांत्रिक ताणांचे वेगळे वितरण होऊ शकते, ज्यामध्ये उच्च परिघीय ताण SAM केंद्रापासून कमी अंतरावर सुरू होतात47. पर्यायीरित्या, pCUC2::gai-1-VENUS SAM आकारविज्ञानातील बदल ट्रान्सजीन अभिव्यक्तीद्वारे प्रेरित प्रादेशिक यांत्रिक गुणधर्मांमधील बदलांमुळे होऊ शकतात48. दोन्ही प्रकरणांमध्ये, हे GA सिग्नलिंगमधील बदलांचे परिणाम अंशतः ऑफसेट करू शकते ज्यामुळे पेशी परिघीय/ट्रान्सव्हर्स ओरिएंटेशनमध्ये विभाजित होण्याची शक्यता वाढू शकते, जे आमचे निरीक्षण स्पष्ट करते.
एकत्रितपणे, आमचा डेटा पुष्टी करतो की उच्च GA सिग्नलिंग IPR मधील पेशी विभाजन समतलच्या पार्श्व अभिमुखतेमध्ये सक्रिय भूमिका बजावते. ते असेही दर्शवतात की मेरिस्टेम वक्रता IPR मधील पेशी विभाजन समतलच्या अभिमुखतेवर देखील प्रभाव पाडते.
IPR मधील डिव्हिजन प्लेनचे ट्रान्सव्हर्स ओरिएंटेशन, उच्च GA सिग्नलिंग क्रियाकलापांमुळे, असे सूचित करते की GA हे SAM मधील एपिडर्मिसमध्ये रेडियल सेल फाइलचे पूर्व-व्यवस्थितीकरण करते जेणेकरून नंतर एपिडर्मल इंटरनोडमध्ये आढळणाऱ्या सेल्युलर ऑर्गनायझेशनची व्याख्या करता येईल. खरंच, अशा सेल फाइल्स डेला ग्लोबल म्युटंट्सच्या SAM प्रतिमांमध्ये वारंवार दिसू लागल्या (आकृती 6b). अशा प्रकारे, SAM मधील GA सिग्नलिंगच्या स्थानिक पॅटर्नच्या विकासात्मक कार्याचा अधिक शोध घेण्यासाठी, आम्ही वाइल्ड-टाइप (Ler आणि Col-0), डेला ग्लोबल म्युटंट्स आणि pCUC2::gai-1-VENUS ट्रान्सजेनिक वनस्पतींमध्ये IPR मधील पेशींच्या स्थानिक ऑर्गनायझेशनचे विश्लेषण करण्यासाठी टाइम-लॅप्स इमेजिंगचा वापर केला.
आम्हाला आढळले की qmRGA ने IPR मधील GA सिग्नलिंग क्रियाकलाप P1/P2 वरून वाढला आणि P4 वर पोहोचला आणि हा नमुना कालांतराने स्थिर राहिला (आकृती 4a–f आणि पूरक आकृती 8c–f, k). वाढत्या GA सिग्नलसह IPR मधील पेशींच्या स्थानिक संघटनेचे विश्लेषण करण्यासाठी, आम्ही पहिल्या निरीक्षणानंतर 34 तासांनी विश्लेषण केलेल्या त्यांच्या विकासात्मक भाग्यानुसार, म्हणजेच दोनपेक्षा जास्त प्लास्टिड वेळा, P1/P2 ते P4 पर्यंत प्रिमॉर्डियम विकासादरम्यान IPR पेशींचे अनुसरण करण्यास अनुमती देणाऱ्या Ler IPR पेशींना P4 च्या वर आणि बाजूंना लेबल केले. आम्ही तीन वेगवेगळे रंग वापरले: P4 जवळ प्रिमॉर्डियममध्ये एकत्रित केलेल्या पेशींसाठी पिवळा, IPR मध्ये असलेल्यांसाठी हिरवा आणि दोन्ही प्रक्रियांमध्ये सहभागी झालेल्यांसाठी जांभळा (आकृती 7a–c). t0 (0 h) वर, P4 च्या समोर IPR पेशींचे 1-2 थर दृश्यमान होते (आकृती 7a). अपेक्षेप्रमाणे, जेव्हा या पेशींचे विभाजन झाले, तेव्हा त्यांनी ते प्रामुख्याने ट्रान्सव्हर्स डिव्हिजन प्लेनद्वारे केले (आकृती 7a–c). Col-0 SAM वापरून समान परिणाम प्राप्त झाले (P3 वर लक्ष केंद्रित करून, ज्याची सीमा Ler मध्ये P4 सारखीच दुमडते), जरी या जीनोटाइपमध्ये फुलांच्या सीमेवर तयार झालेल्या पटाने IPR पेशी अधिक जलद लपवल्या (आकृती 7g–i). अशाप्रकारे, IPR पेशींचा विभाजन नमुना पेशींना इंटरनोड्सप्रमाणे रेडियल ओळींमध्ये पूर्व-व्यवस्थित करतो. रेडियल ओळींचे संघटन आणि सलग अवयवांमधील IPR पेशींचे स्थानिकीकरण सूचित करते की या पेशी इंटरनोडल प्रोजेनिटर आहेत.
येथे, आम्ही एक रेशियोमेट्रिक GA सिग्नलिंग बायोसेन्सर, qmRGA विकसित केला आहे, जो GA आणि GA रिसेप्टर सांद्रतेमुळे निर्माण होणाऱ्या GA सिग्नलिंग क्रियाकलापांचे परिमाणात्मक मॅपिंग करण्यास अनुमती देतो आणि अंतर्जात सिग्नलिंग मार्गांमध्ये हस्तक्षेप कमी करतो, ज्यामुळे सेल्युलर स्तरावर GA कार्याबद्दल माहिती प्रदान करतो. यासाठी, आम्ही एक सुधारित DELLA प्रथिने, mRGA तयार केले आहे, ज्याने DELLA परस्परसंवाद भागीदारांना बांधण्याची क्षमता गमावली आहे परंतु GA-प्रेरित प्रोटीओलिसिससाठी संवेदनशील राहते. qmRGA GA पातळींमधील बाह्य आणि अंतर्जात दोन्ही बदलांना प्रतिसाद देते आणि त्याचे गतिमान संवेदन गुणधर्म विकासादरम्यान GA सिग्नलिंग क्रियाकलापातील स्थानिक बदलांचे मूल्यांकन करण्यास सक्षम करतात. qmRGA हे देखील एक अतिशय लवचिक साधन आहे कारण ते त्याच्या अभिव्यक्तीसाठी वापरल्या जाणाऱ्या प्रमोटरला (आवश्यक असल्यास) बदलून वेगवेगळ्या ऊतींमध्ये अनुकूल केले जाऊ शकते आणि GA सिग्नलिंग मार्गाचे संरक्षित स्वरूप आणि अँजिओस्पर्म्समध्ये PFYRE आकृतिबंध पाहता, ते इतर प्रजातींमध्ये हस्तांतरित होण्याची शक्यता आहे. याच्याशी सुसंगत, तांदळाच्या SLR1 DELLA प्रथिनातील (HYY497AAA) समतुल्य उत्परिवर्तन देखील SLR1 च्या वाढ दाबणाऱ्या क्रियाकलापांना दडपून टाकते असे दिसून आले आहे, तर mRGA23 प्रमाणेच त्याचे GA-मध्यस्थ क्षयीकरण थोडेसे कमी करते. उल्लेखनीय म्हणजे, अरेबिडोप्सिसमधील अलीकडील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की PFYRE डोमेन (S474L) मधील एका अमीनो आम्ल उत्परिवर्तनाने RGA च्या ट्रान्सक्रिप्शनल क्रियाकलापात बदल केला आहे, परंतु ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर पार्टनर्सशी संवाद साधण्याची त्याची क्षमता प्रभावित केली नाही. जरी हे उत्परिवर्तन mRGA मध्ये उपस्थित असलेल्या 3 अमीनो आम्ल प्रतिस्थापनांच्या अगदी जवळ असले तरी, आमच्या अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की हे दोन उत्परिवर्तन DELLA च्या विशिष्ट वैशिष्ट्यांमध्ये बदल करतात. जरी बहुतेक ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर पार्टनर्स DELLA च्या LHR1 आणि SAW डोमेनशी बांधले जातात26,51, PFYRE डोमेनमधील काही संरक्षित अमीनो आम्ल या परस्परसंवादांना स्थिर करण्यास मदत करू शकतात.
वनस्पतींच्या वास्तुकला आणि उत्पन्न सुधारणेमध्ये इंटरनोड विकास हा एक महत्त्वाचा गुणधर्म आहे. qmRGA ने IPR इंटरनोड प्रोजेनिटर पेशींमध्ये उच्च GA सिग्नलिंग क्रियाकलाप उघड केला. परिमाणात्मक इमेजिंग आणि अनुवंशशास्त्र एकत्र करून, आम्ही दाखवून दिले की GA सिग्नलिंग पॅटर्न SAM एपिडर्मिसमध्ये वर्तुळाकार/ट्रान्सव्हर्स सेल डिव्हिजन प्लेन सुपरइम्पोज करतात, इंटरनोड डेव्हलपमेंटसाठी आवश्यक असलेल्या सेल डिव्हिजन ऑर्गनायझेशनला आकार देतात. विकासादरम्यान सेल डिव्हिजन प्लेन ओरिएंटेशनचे अनेक नियामक ओळखले गेले आहेत52,53. आमचे काम GA सिग्नलिंग क्रियाकलाप या सेल्युलर पॅरामीटरचे नियमन कसे करते याचे स्पष्ट उदाहरण देते. DELLA प्रीफोल्डिंग प्रोटीन कॉम्प्लेक्सशी संवाद साधू शकते41, म्हणून GA सिग्नलिंग कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल ओरिएंटेशनवर थेट प्रभाव टाकून सेल डिव्हिजन प्लेन ओरिएंटेशनचे नियमन करू शकते40,41,54,55. आम्ही अनपेक्षितपणे दाखवून दिले की SAM मध्ये, उच्च GA सिग्नलिंग क्रियाकलापाचा सहसंबंध पेशी वाढवणे किंवा विभाजन नव्हते, तर केवळ वाढ अॅनिसोट्रॉपी होते, जे IPR मध्ये सेल डिव्हिजनच्या दिशेने GA च्या थेट परिणामाशी सुसंगत आहे. तथापि, आपण हे वगळू शकत नाही की हा परिणाम अप्रत्यक्ष देखील असू शकतो, उदाहरणार्थ GA-प्रेरित पेशी भिंत मृदूकरण द्वारे मध्यस्थी56. पेशी भिंत गुणधर्मांमधील बदल यांत्रिक ताण निर्माण करतात57,58, जे कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्सच्या अभिमुखतेवर परिणाम करून पेशी विभाजन समतलच्या अभिमुखतेवर देखील प्रभाव टाकू शकते39,46,59. GA-प्रेरित यांत्रिक ताण आणि GA द्वारे सूक्ष्मट्यूब्यूल अभिमुखतेचे थेट नियमन यांचे एकत्रित परिणाम इंटरनोड्स परिभाषित करण्यासाठी IPR मध्ये पेशी विभाजन अभिमुखतेचा एक विशिष्ट नमुना निर्माण करण्यात गुंतलेले असू शकतात आणि या कल्पनेची चाचणी घेण्यासाठी पुढील अभ्यास आवश्यक आहेत. त्याचप्रमाणे, मागील अभ्यासांनी इंटरनोड निर्मितीच्या नियंत्रणात DELLA-परस्परसंवाद करणाऱ्या प्रथिनांचे TCP14 आणि 15 चे महत्त्व अधोरेखित केले आहे60,61 आणि हे घटक BREVIPEDICELLUS (BP) आणि PENNYWISE (PNY) सोबत GA च्या क्रियेत मध्यस्थी करू शकतात, जे इंटरनोड विकासाचे नियमन करतात आणि GA सिग्नलिंगवर प्रभाव पाडतात2,62. DELLAs ब्रासिनोस्टेरॉइड, इथिलीन, जॅस्मोनिक अॅसिड आणि अॅब्सिसिक अॅसिड (ABA) सिग्नलिंग मार्गांशी संवाद साधतात63,64 आणि हे हार्मोन्स मायक्रोट्यूब्यूल ओरिएंटेशनवर प्रभाव टाकू शकतात65 हे लक्षात घेता, GA चा पेशी विभाजन ओरिएंटेशनवरील परिणाम इतर हार्मोन्सद्वारे देखील मध्यस्थी केला जाऊ शकतो.
सुरुवातीच्या सायटोलॉजिकल अभ्यासातून असे दिसून आले की इंटरनोड विकासासाठी अरेबिडोप्सिस एसएएमचे आतील आणि बाहेरील दोन्ही भाग आवश्यक आहेत2,42. GA आतील ऊतींमध्ये पेशी विभाजन सक्रियपणे नियंत्रित करते ही वस्तुस्थिती 12 एसएएममध्ये मेरिस्टेम आणि इंटरनोड आकार नियंत्रित करण्यात GA च्या दुहेरी कार्याचे समर्थन करते. आतील एसएएम ऊतींमध्ये दिशात्मक पेशी विभाजनाचा नमुना देखील कडकपणे नियंत्रित केला जातो आणि हे नियमन स्टेम वाढीसाठी आवश्यक आहे52. आतील एसएएम संघटनेत पेशी विभाजन समतलाला दिशा देण्यामध्ये GA देखील भूमिका बजावते का हे तपासणे मनोरंजक असेल, ज्यामुळे एसएएममधील इंटरनोड्सचे स्पेसिफिकेशन आणि विकास समक्रमित होतो.
मातीमध्ये किंवा १x मुराशिगे-स्कूग (एमएस) माध्यम (डुचेफा) मध्ये १% सुक्रोज आणि १% आगर (सिग्मा) प्रमाणित परिस्थितीत (१६ तास प्रकाश, २२ अंश सेल्सिअस) वाढवून रोपे उभी प्लेट्सवर स्थिर प्रकाश आणि २२ अंश सेल्सिअस तापमानात वाढवली गेली. नायट्रेट प्रयोगांसाठी, रोपे सुधारित एमएस माध्यम (बायोवर्ल्ड वनस्पती माध्यम) वर वाढवली गेली ज्यामध्ये पुरेशा नायट्रेट (० किंवा १० मिमी केएनओ३), ०.५ मिमी एनएच४-सक्सीनेट, १% सुक्रोज आणि १% ए-अगर (सिग्मा) दीर्घ-दिवसाच्या परिस्थितीत पुरविण्यात आले.
pDONR221 मध्ये घातलेला GID1a cDNA pDONR P4-P1R-pUBQ10 आणि pDONR P2R-P3-mCherry सह pB7m34GW मध्ये पुन्हा एकत्रित करून pUBQ10::GID1a-mCherry निर्माण केले. pDONR221 मध्ये घातलेला IDD2 DNA p35S:IDD2-RFP निर्माण करण्यासाठी pB7RWG266 मध्ये पुन्हा एकत्रित करून तयार केला. pGID1b::2xmTQ2-GID1b निर्माण करण्यासाठी, GID1b कोडिंग क्षेत्राच्या अपस्ट्रीममधील 3.9 kb तुकडा आणि GID1b cDNA (1.3 kb) आणि टर्मिनेटर (3.4 kb) असलेला 4.7 kb तुकडा प्रथम पूरक तक्ता 3 मधील प्राइमर्स वापरून प्रवर्धित केला गेला आणि नंतर अनुक्रमे pDONR P4-P1R (थर्मो फिशर सायंटिफिक) आणि pDONR P2R-P3 (थर्मो फिशर सायंटिफिक) मध्ये समाविष्ट केला गेला आणि शेवटी गेटवे क्लोनिंग वापरून pGreen 012567 लक्ष्य वेक्टरमध्ये pDONR221 2xmTQ268 सह पुन्हा एकत्रित केले गेले. pCUC2::LSSmOrange निर्माण करण्यासाठी, CUC2 प्रमोटर सीक्वेन्स (ATG च्या 3229 bp अपस्ट्रीम) त्यानंतर मोठ्या स्टोक्स-शिफ्ट केलेल्या mOrange (LSSmOrange)69 चा कोडिंग सीक्वेन्स N7 न्यूक्लियर लोकलायझेशन सिग्नलसह आणि NOS ट्रान्सक्रिप्शनल टर्मिनेटरला गेटवे 3-फ्रॅगमेंट रीकॉम्बिनेशन सिस्टम (इन्व्हिट्रोजन) वापरून pGreen kanamycin टार्गेटिंग वेक्टरमध्ये एकत्र केले गेले. प्लांट बायनरी वेक्टर अ‍ॅग्रोबॅक्टेरियम ट्यूमेफेसियन्स स्ट्रेन GV3101 मध्ये आणला गेला आणि अ‍ॅग्रोबॅक्टेरियम इन्फ्लिट्रेशन पद्धतीने निकोटियाना बेंथामियाना पानांमध्ये आणि फ्लोरल डिप पद्धतीने अ‍ॅरेबिडोप्सिस थालियाना कोल-0 मध्ये आणला गेला. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry आणि pCLV3::mCherry-NLS qmRGA अनुक्रमे संबंधित क्रॉसच्या F3 आणि F1 संततीपासून वेगळे केले गेले.
आरएनए इन सिटू हायब्रिडायझेशन अंदाजे १ सेमी लांबीच्या शूट टिप्सवर करण्यात आले72, जे गोळा केले गेले आणि ताबडतोब FAA द्रावणात (3.7% फॉर्मल्डिहाइड, 5% एसिटिक अॅसिड, 50% इथेनॉल) फिक्स केले गेले जे ४ °C पर्यंत प्री-कूल केले गेले. २ × १५ मिनिटांच्या व्हॅक्यूम ट्रीटमेंटनंतर, फिक्सेटिव्ह बदलण्यात आला आणि नमुने रात्रभर इनक्युबेट केले गेले. रोझियर एट अल.73 द्वारे वर्णन केल्याप्रमाणे पूरक तक्ता 3 मध्ये दर्शविलेल्या प्राइमर्सचा वापर करून त्यांच्या 3′-UTRs चे GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, आणि RGL3 cDNA आणि अँटीसेन्स प्रोब्सचे संश्लेषण करण्यात आले. डिगॉक्सिजेनिन-लेबल असलेल्या प्रोब्सना डिगॉक्सिजेनिन अँटीबॉडीज (३०००-पट डायल्युशन; रोश, कॅटलॉग क्रमांक: ११ ०९३ २७४ ९१०) वापरून इम्युनोडिटेक्ट केले गेले आणि त्या भागांना ५-ब्रोमो-४-क्लोरो-३-इंडोलिल फॉस्फेट (बीसीआयपी, २५०-पट डायल्युशन)/नायट्रोब्लू टेट्राझोलियम (एनबीटी, २००-पट डायल्युशन) द्रावणाने रंगवले गेले.