संख्यात्मक जिबरेलिन बायोसेन्सर शूट एपिकल मेरिस्टेममधील इंटरनोड स्पेसिफिकेशनमध्ये जिबरेलिनची भूमिका उघड करतो

खोडाच्या रचनेसाठी शूट एपिकल मेरिस्टेम (SAM) ची वाढ महत्त्वपूर्ण आहे. वनस्पती संप्रेरकेजिबरेलिन्सवनस्पतींच्या वाढीच्या समन्वयामध्ये जीए (GAs) महत्त्वाची भूमिका बजावतात, परंतु एसएएम (SAM) मधील त्यांची भूमिका अद्याप पूर्णपणे समजलेली नाही. येथे, आम्ही डेला (DELLA) प्रथिनामध्ये बदल करून जीए सिग्नलिंगचा एक रॅटिओमेट्रिक बायोसेन्सर विकसित केला आहे. या बदलामुळे जीए ट्रान्सक्रिप्शनल प्रतिसादातील त्याचे आवश्यक नियामक कार्य दाबले जाते, परंतु जीए ओळखल्यानंतर होणारे त्याचे विघटन कायम राखले जाते. आम्ही हे दाखवून देतो की हा विघटन-आधारित बायोसेन्सर विकासादरम्यान जीए पातळीतील बदल आणि पेशीय संवेदनाची अचूक नोंद करतो. आम्ही या बायोसेन्सरचा वापर एसएएममधील जीए सिग्नलिंग क्रियाकलापांचे मॅपिंग करण्यासाठी केला. आम्ही हे दाखवून देतो की उच्च जीए सिग्नल प्रामुख्याने अवयवांच्या आद्यरूपांमध्ये (organ primordia) असलेल्या पेशींमध्ये आढळतात, जे आंतरपर्व ​​पेशींचे पूर्वसूचक आहेत. गेन-ऑफ-फंक्शन आणि लॉस-ऑफ-फंक्शन पद्धतींचा वापर करून, आम्ही पुढे हे दाखवून देतो की जीए पेशी विभाजनाच्या प्रतलाची दिशा नियंत्रित करतो, आंतरपर्वांची प्रमाणित पेशीय रचना स्थापित करतो आणि त्याद्वारे एसएएममध्ये आंतरपर्वांच्या विशिष्टीकरणास प्रोत्साहन देतो.
शूट एपिकल मेरिस्टेम (SAM), जे शूटच्या टोकावर स्थित असते, त्यात स्टेम सेल्सची एक जागा असते, ज्यांच्या क्रियेमुळे वनस्पतीच्या संपूर्ण जीवनकाळात एका विशिष्ट क्रमाने आणि पुनरावृत्तीच्या पद्धतीने बाजूचे अवयव आणि खोडावरील पेरे तयार होतात. या प्रत्येक पुनरावृत्त होणाऱ्या घटकांमध्ये, किंवा वनस्पती पेरांमध्ये, पेऱ्यांवरील आंतरपेरे आणि बाजूचे अवयव, आणि पानांच्या काखेत कक्षीय मेरिस्टेम यांचा समावेश असतो¹. विकासादरम्यान वनस्पती पेऱ्यांची वाढ आणि रचना बदलते. ॲराबिडॉप्सिसमध्ये, शाकीय अवस्थेदरम्यान आंतरपेऱ्यांची वाढ दडपली जाते आणि कक्षीय मेरिस्टेम रोझेट पानांच्या काखेत सुप्त अवस्थेत राहतात. फुलांच्या अवस्थेत संक्रमण होत असताना, SAM हे पुष्पगुच्छ मेरिस्टेम बनते, जे लांबट आंतरपेरे आणि कक्षीय कळ्या, खोडावरील पानांच्या काखेत लहान फांद्या आणि नंतर, पर्णहीन फुले² तयार करते. पाने, फुले आणि फांद्या यांच्या निर्मितीवर नियंत्रण ठेवणाऱ्या यंत्रणा समजून घेण्यात आपण लक्षणीय प्रगती केली असली तरी, आंतरपेरे कशी निर्माण होतात याबद्दल तुलनेने कमी माहिती आहे.
जीएच्या (GAs) अवकाशीय-कालानुरूप वितरणाची माहिती घेतल्यास, वेगवेगळ्या उतींमध्ये आणि विकासाच्या विविध टप्प्यांवर या संप्रेरकांची कार्ये अधिक चांगल्या प्रकारे समजून घेण्यास मदत होईल. स्वतःच्या प्रमोटरच्या प्रभावाखाली व्यक्त होणाऱ्या RGA-GFP फ्यूजनच्या ऱ्हासाचे दृश्यांकन, मुळांमधील एकूण जीएच्या पातळीच्या नियमनाविषयी महत्त्वाची माहिती पुरवते¹⁵,¹⁶. तथापि, RGA ची अभिव्यक्ती वेगवेगळ्या उतींमध्ये बदलते¹⁷ आणि ती जीएद्वारे (GA) नियंत्रित केली जाते¹⁸. त्यामुळे, RGA प्रमोटरच्या भिन्न अभिव्यक्तीमुळे RGA-GFP मध्ये दिसणारा प्रतिदीप्तीचा नमुना (fluorescence pattern) दिसू शकतो आणि म्हणूनच ही पद्धत परिमाणात्मक नाही. अगदी अलीकडे, जैवक्रियाशील फ्लुरोसीन (Fl)-लेबल केलेल्या जीए¹⁹,²⁰ ने मुळांच्या एंडोकॉर्टेक्समध्ये जीएचा संचय आणि जीए वहनाद्वारे त्याच्या पेशीय पातळ्यांचे नियमन उघड केले. अलीकडेच, जीए एफआरईटी सेन्सर nlsGPS1 ने दाखवले की जीएची पातळी मुळे, तंतू आणि अंधारात वाढलेल्या हायपोकॉटिल्समधील पेशींच्या लांबीशी संबंधित आहे²¹. तथापि, जसे आपण पाहिले आहे, जीएची संहती (concentration) हा जीए सिग्नलिंग क्रियाकलाप नियंत्रित करणारा एकमेव घटक नाही, कारण तो जटिल संवेदन प्रक्रियांवर अवलंबून असतो. येथे, डेला (DELLA) आणि जीए (GA) सिग्नलिंग मार्गांच्या आमच्या समजावर आधारित, आम्ही जीए सिग्नलिंगसाठी एका डिग्रेडेशन-आधारित रॅटिओमेट्रिक बायोसेन्सरचा विकास आणि वैशिष्ट्यीकरण सादर करत आहोत. हा परिमाणात्मक बायोसेन्सर विकसित करण्यासाठी, आम्ही एका म्युटंट जीए-संवेदनशील आरजीएचा वापर केला, जो एका फ्लोरोसेंट प्रोटीनशी जोडलेला होता आणि ऊतींमध्ये सर्वत्र व्यक्त केला जात होता, तसेच एका जीए-असंवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीनचाही वापर केला. आम्ही दाखवतो की, जेव्हा म्युटंट आरजीए प्रोटीन फ्युजन सर्वत्र व्यक्त केले जातात, तेव्हा ते अंतर्जात जीए सिग्नलिंगमध्ये हस्तक्षेप करत नाहीत, आणि हा बायोसेन्सर जीए इनपुट आणि संवेदन उपकरणाद्वारे होणाऱ्या जीए सिग्नल प्रोसेसिंग या दोन्हींमुळे निर्माण होणाऱ्या सिग्नलिंग क्रियेचे उच्च स्पॅटिओटेम्पोरल रिझोल्यूशनसह परिमाणीकरण करू शकतो. आम्ही या बायोसेन्सरचा वापर जीए सिग्नलिंग क्रियेच्या स्पॅटिओटेम्पोरल वितरणाचा नकाशा तयार करण्यासाठी आणि सॅम (SAM) एपिडर्मिसमध्ये जीए पेशीय वर्तनाचे नियमन कसे करते याचे परिमाणीकरण करण्यासाठी केला. आम्ही हे दाखवून देतो की जीए अवयवांच्या आद्यरूपांमध्ये (organ primordia) असलेल्या सॅम पेशींच्या विभाजन प्रतलाच्या अभिमुखतेचे नियमन करते, ज्यामुळे इंटरनोडची प्रमाणित पेशीय रचना निश्चित होते.
शेवटी, आम्ही विचारले की qmRGA वाढणाऱ्या अधोबीजपत्रांचा वापर करून अंतर्जात GA पातळीतील बदलांची नोंद करू शकते का. आम्ही पूर्वी दाखवले होते की नायट्रेट GA संश्लेषण वाढवून आणि परिणामी, DELLA34 चे विघटन वाढवून वाढीस उत्तेजित करते. त्यानुसार, आम्ही पाहिले की मुबलक नायट्रेट पुरवठ्याखाली (10 mM NO3−) वाढलेल्या pUBQ10::qmRGA रोपांमधील अधोबीजपत्रांची लांबी, नायट्रेट-कमतरतेच्या परिस्थितीत वाढलेल्या रोपांपेक्षा लक्षणीयरीत्या जास्त होती (पूरक आकृती 6a). वाढीच्या प्रतिसादाशी सुसंगतपणे, नायट्रेटच्या अनुपस्थितीत वाढलेल्या रोपांपेक्षा 10 mM NO3− परिस्थितीत वाढलेल्या रोपांच्या अधोबीजपत्रांमध्ये GA सिग्नल जास्त होते (पूरक आकृती 6b, c). अशाप्रकारे, qmRGA अंतर्जात GA सांद्रतेतील बदलांमुळे प्रेरित GA सिग्नलिंगमधील बदलांचे निरीक्षण करण्यास देखील सक्षम करते.
सेन्सरच्या रचनेनुसार अपेक्षित असल्याप्रमाणे, qmRGA द्वारे शोधलेली GA सिग्नलिंग क्रिया GA सांद्रता आणि GA संवेदनेवर अवलंबून आहे की नाही हे समजून घेण्यासाठी, आम्ही शाकीय आणि प्रजनन ऊतींमध्ये तीन GID1 रिसेप्टर्सच्या अभिव्यक्तीचे विश्लेषण केले. रोपांमध्ये, GID1-GUS रिपोर्टर लाइनने दाखवले की GID1a आणि c हे बीजपत्रांमध्ये (cotyledons) उच्च प्रमाणात अभिव्यक्त झाले होते (आकृती 3a–c). याव्यतिरिक्त, तिन्ही रिसेप्टर्स पाने, पार्श्विक मूळ प्रारंभ (lateral root primordia), मूळ टोके (GID1b च्या मूळ टोपीचा अपवाद वगळता), आणि संवहनी संस्थेमध्ये (vascular system) अभिव्यक्त झाले होते (आकृती 3a–c). पुष्पगुच्छ SAM मध्ये, आम्हाला फक्त GID1b आणि 1c साठी GUS सिग्नल आढळले (पूरक आकृती 7a–c). इन सिटू हायब्रिडायझेशनने (In situ hybridization) या अभिव्यक्तीच्या पद्धतींची पुष्टी केली आणि पुढे हे सिद्ध केले की GID1c हे SAM मध्ये कमी पातळीवर एकसमानपणे अभिव्यक्त झाले होते, तर GID1b ने SAM च्या परिघावर उच्च अभिव्यक्ती दर्शविली (पूरक आकृती 7d–l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b ट्रान्सलेशनल फ्यूजनने GID1b अभिव्यक्तीची एक श्रेणीबद्ध श्रेणी देखील उघड केली, जी SAM च्या मध्यभागी कमी किंवा शून्य अभिव्यक्तीपासून ते अवयवांच्या कडांवर उच्च अभिव्यक्तीपर्यंत होती (पूरक आकृती 7m). अशाप्रकारे, GID1 रिसेप्टर्स ऊतींमध्ये आणि ऊतींच्या आत एकसमानपणे वितरित नाहीत. त्यानंतरच्या प्रयोगांमध्ये, आम्ही असेही पाहिले की GID1 च्या अतिअभिव्यक्तीमुळे (pUBQ10::GID1a-mCherry) हायपोकॉटिल्समधील qmRGA ची बाह्य GA प्रयोगाप्रती संवेदनशीलता वाढली (आकृती 3d, e). याउलट, हायपोकॉटिलमध्ये qd17mRGA द्वारे मोजलेली फ्लुरोसेन्स GA3 उपचारास असंवेदनशील होती (आकृती 3f, g). दोन्ही चाचण्यांसाठी, सेन्सरच्या जलद वर्तनाचे मूल्यांकन करण्यासाठी रोपांवर GA च्या उच्च सांद्रतेने (100 μM GA3) उपचार केले गेले, जिथे GID1 रिसेप्टरला बांधण्याची क्षमता वाढली किंवा नाहीशी झाली. एकत्रितपणे, हे परिणाम पुष्टी करतात की qmRGA बायोसेन्सर GA आणि GA सेन्सर म्हणून एकत्रित कार्य करतो आणि असे सूचित करतात की GID1 रिसेप्टरची भिन्न अभिव्यक्ती सेन्सरच्या उत्सर्जनक्षमतेत लक्षणीयरीत्या बदल घडवू शकते.
आजपर्यंत, SAM मधील GA सिग्नलचे वितरण अस्पष्ट आहे. म्हणून, आम्ही qmRGA-व्यक्त करणाऱ्या वनस्पती आणि pCLV3::mCherry-NLS स्टेम सेल रिपोर्टर35 वापरून GA सिग्नलिंग क्रियेचे उच्च-रिझोल्यूशन परिमाणात्मक नकाशे तयार केले, ज्यामध्ये L1 थरावर (बाह्यत्वचा; आकृती 4a, b, पद्धती आणि पूरक पद्धती पहा) लक्ष केंद्रित केले, कारण L1 थर SAM च्या वाढीवर नियंत्रण ठेवण्यात महत्त्वाची भूमिका बजावतो36. येथे, pCLV3::mCherry-NLS अभिव्यक्तीने GA सिग्नलिंग क्रियेच्या अवकाशीय-कालानुरूप वितरणाचे विश्लेषण करण्यासाठी एक निश्चित भौमितिक संदर्भ बिंदू प्रदान केला37. जरी GA पार्श्व अवयवांच्या विकासासाठी आवश्यक मानले जाते4, तरी आमच्या लक्षात आले की P3 अवस्थेपासून सुरू होणाऱ्या पुष्प आद्यरूपामध्ये (P) GA सिग्नल कमी होते (आकृती 4a, b), तर तरुण P1 आणि P2 आद्यरूपांमध्ये मध्यवर्ती भागाप्रमाणेच मध्यम क्रियाशीलता होती (आकृती 4a, b). अवयवांच्या आद्य-बीजांच्या सीमांवर, P1/P2 पासून (सीमेच्या बाजूंना) सुरू होऊन P4 ला सर्वोच्च पातळीवर पोहोचणारी, तसेच आद्य-बीजांच्या दरम्यान असलेल्या परिघीय भागातील सर्व पेशींमध्ये उच्च GA सिग्नलिंग क्रियाशीलता आढळून आली (आकृती 4a, b आणि पूरक आकृती 8a, b). ही उच्च GA सिग्नलिंग क्रियाशीलता केवळ बाह्यत्वचेतच नव्हे, तर L2 आणि वरच्या L3 थरांमध्येही दिसून आली (पूरक आकृती 8b). qmRGA वापरून SAM मध्ये आढळलेला GA सिग्नलचा नमुना देखील कालांतराने अपरिवर्तित राहिला (पूरक आकृती 8c–f, k). जरी आम्ही तपशीलवार अभ्यासलेल्या पाच स्वतंत्र वंशांमधील T3 वनस्पतींच्या SAM मध्ये qd17mRGA कन्स्ट्रक्ट पद्धतशीरपणे डाउनरेगुलेट झाला होता, तरीही आम्ही pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP कन्स्ट्रक्टने मिळवलेल्या फ्लुरोसेन्स नमुन्यांचे विश्लेषण करू शकलो (पूरक आकृती 8g–j, l). या नियंत्रण रेषेत, SAM मध्ये प्रतिदीप्ती गुणोत्तरात केवळ किरकोळ बदल आढळले, परंतु SAM केंद्रामध्ये आम्हाला TagBFP शी संबंधित VENUS मध्ये एक स्पष्ट आणि अनपेक्षित घट दिसून आली. हे पुष्टी करते की qmRGA द्वारे निरीक्षण केलेला सिग्नलिंग पॅटर्न हा mRGA-VENUS च्या GA-अवलंबित क्षरणाला प्रतिबिंबित करतो, परंतु हे देखील दर्शवितो की qmRGA मेरिस्टेम केंद्रातील GA सिग्नलिंग क्रियाशीलतेचा कदाचित जास्त अंदाज लावू शकते. सारांश, आमचे निष्कर्ष एक असा GA सिग्नलिंग पॅटर्न उघड करतात जो प्रामुख्याने प्रिमॉर्डीयाच्या वितरणाला प्रतिबिंबित करतो. आंतर-प्रिमॉर्डीयल प्रदेशाचे (IPR) हे वितरण, विकसित होत असलेल्या प्रिमॉर्डियम आणि मध्यवर्ती प्रदेश यांच्यामध्ये उच्च GA सिग्नलिंग क्रियाशीलतेच्या हळूहळू स्थापनेमुळे आहे, तर त्याच वेळी प्रिमॉर्डियममधील GA सिग्नलिंग क्रियाशीलता कमी होते (आकृती ४c, d).
GID1b आणि GID1c रिसेप्टर्सचे वितरण (वर पहा) असे सूचित करते की GA रिसेप्टर्सची भिन्न अभिव्यक्ती SAM मधील GA सिग्नलिंग क्रियाकलापांचा नमुना आकारण्यात मदत करते. आम्हाला आश्चर्य वाटले की GA चा भिन्न संचय यात सामील असू शकतो का. या शक्यतेची तपासणी करण्यासाठी, आम्ही nlsGPS1 GA FRET सेन्सर21 वापरला. 10 μM GA4+7 सह 100 मिनिटांसाठी उपचार केलेल्या nlsGPS1 च्या SAM मध्ये वाढलेली सक्रियता वारंवारता आढळली (पूरक आकृती 9a–e), हे दर्शवते की nlsGPS1 मुळांप्रमाणेच SAM मधील GA एकाग्रतेतील बदलांना प्रतिसाद देतो21. nlsGPS1 सक्रियता वारंवारतेच्या अवकाशीय वितरणाने SAM च्या बाह्य थरांमध्ये GA ची पातळी तुलनेने कमी असल्याचे उघड केले, परंतु ते SAM च्या मध्यभागी आणि कडांवर वाढलेले असल्याचे दर्शविले (आकृती 4e आणि पूरक आकृती 9a,c). हे सूचित करते की GA, qmRGA द्वारे प्रकट झालेल्या अवकाशीय नमुन्याशी तुलना करता येण्याजोग्या नमुन्यासह SAM मध्ये देखील वितरित आहे. एक पूरक दृष्टिकोन म्हणून, आम्ही नकारात्मक नियंत्रण म्हणून SAM वर प्रतिदीप्त GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) किंवा केवळ Fl ने देखील उपचार केले. Fl सिग्नल संपूर्ण SAM मध्ये, मध्यवर्ती प्रदेश आणि प्रिमॉर्डियमसह, वितरित झाला होता, जरी त्याची तीव्रता कमी होती (आकृती 4j आणि पूरक आकृती 10d). याउलट, तिन्ही GA-Fl विशेषतः प्रिमॉर्डियमच्या सीमांमध्ये आणि उर्वरित IPR मध्ये वेगवेगळ्या प्रमाणात जमा झाले, ज्यात GA7-Fl IPR मधील सर्वात मोठ्या क्षेत्रात जमा झाले (आकृती 4k आणि पूरक आकृती 10a,b). प्रतिदीप्ती तीव्रतेच्या प्रमाणीकरणातून असे दिसून आले की Fl-उपचारित SAM च्या तुलनेत GA-Fl-उपचारित SAM मध्ये IPR ते नॉन-IPR तीव्रतेचे गुणोत्तर जास्त होते (आकृती 4l आणि पूरक आकृती 10c). एकत्रितपणे, हे परिणाम सूचित करतात की GA अवयवाच्या सीमेजवळ असलेल्या IPR पेशींमध्ये जास्त प्रमाणात उपस्थित असते. यावरून असे सूचित होते की, SAM मधील GA सिग्नलिंग क्रियेचा आकृतिबंध हा GA रिसेप्टर्सच्या भिन्न अभिव्यक्तीमुळे आणि अवयवाच्या सीमांजवळील IPR पेशींमध्ये GA च्या भिन्न संचयनामुळे निर्माण होतो. अशाप्रकारे, आमच्या विश्लेषणातून GA सिग्नलिंगचा एक अनपेक्षित अवकाशी-कालानुक्रमी आकृतिबंध समोर आला, ज्यामध्ये SAM च्या केंद्र आणि आद्यभागात कमी क्रियाशीलता आणि परिघीय प्रदेशातील IPR मध्ये जास्त क्रियाशीलता दिसून आली.
SAM मधील भिन्न GA सिग्नलिंग क्रियेची भूमिका समजून घेण्यासाठी, आम्ही SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS च्या रिअल-टाइम टाइम-लॅप्स इमेजिंगचा वापर करून GA सिग्नलिंग क्रिया, पेशी विस्तार आणि पेशी विभाजन यांच्यातील सहसंबंधाचे विश्लेषण केले. वाढ नियमनामध्ये GA ची भूमिका लक्षात घेता, पेशी विस्ताराच्या मापदंडांशी सकारात्मक सहसंबंध अपेक्षित होता. म्हणून, आम्ही प्रथम GA सिग्नलिंग क्रियेच्या नकाशांची तुलना पेशी पृष्ठभागाच्या वाढीच्या दराच्या नकाशांशी (एका विशिष्ट पेशीसाठी आणि विभाजनाच्या वेळी कन्या पेशींसाठी पेशी विस्ताराच्या तीव्रतेचा निर्देशक म्हणून) आणि वाढीच्या अनिसोट्रॉपीच्या नकाशांशी केली, जे पेशी विस्ताराची दिशात्मकता मोजते (येथे एका विशिष्ट पेशीसाठी आणि विभाजनाच्या वेळी कन्या पेशींसाठी देखील वापरले आहे; आकृती 5a,b, पद्धती आणि पूरक पद्धती पहा). SAM पेशी पृष्ठभागाच्या वाढीच्या दराचे आमचे नकाशे मागील निरीक्षणांशी सुसंगत आहेत38,39, ज्यामध्ये सीमेवर किमान वाढीचा दर आणि विकसित होणाऱ्या फुलांमध्ये कमाल वाढीचा दर आढळतो (आकृती 5a). प्रिन्सिपल कंपोनेंट ॲनालिसिस (PCA) ने दाखवले की GA सिग्नलिंग क्रिया पेशी पृष्ठभागाच्या वाढीच्या तीव्रतेशी नकारात्मक सहसंबंधित होती (आकृती 5c). आम्ही हे देखील दाखवले की, GA सिग्नलिंग इनपुट आणि वाढीची तीव्रता यांसारखे बदलाचे मुख्य अक्ष, उच्च CLV3 अभिव्यक्तीद्वारे निर्धारित दिशेला लंब होते, ज्यामुळे उर्वरित विश्लेषणांमध्ये SAM केंद्रातील पेशी वगळण्याची पुष्टी झाली. स्पीअरमन सहसंबंध विश्लेषणाने PCA परिणामांची पुष्टी केली (आकृती 5d), ज्यावरून असे दिसून आले की IPR मधील उच्च GA सिग्नलमुळे पेशींचा अधिक विस्तार झाला नाही. तथापि, सहसंबंध विश्लेषणाने GA सिग्नलिंग क्रियाकलाप आणि वाढीची विषमदिक्ता यांच्यात एक किंचित सकारात्मक सहसंबंध उघड केला (आकृती 5c, d), ज्यावरून असे सूचित होते की IPR मधील उच्च GA सिग्नलिंग पेशींच्या वाढीच्या दिशेवर आणि शक्यतो पेशी विभाजन प्रतलाच्या स्थितीवर प्रभाव टाकते.
a, b सात स्वतंत्र वनस्पतींवरून सरासरी काढलेल्या SAM मधील सरासरी पृष्ठभागीय वाढ (a) आणि वाढ विषमतेचे (b) हीट मॅप (अनुक्रमे पेशी विस्ताराची शक्ती आणि दिशा दर्शवण्यासाठी वापरलेले). c PCA विश्लेषणात खालील चल समाविष्ट होते: GA सिग्नल, पृष्ठभागीय वाढीची तीव्रता, पृष्ठभागीय वाढीची विषमता आणि CLV3 अभिव्यक्ती. PCA घटक 1 मुख्यत्वे पृष्ठभागीय वाढीच्या तीव्रतेशी नकारात्मक सहसंबंधित आणि GA सिग्नलशी सकारात्मक सहसंबंधित होता. PCA घटक 2 मुख्यत्वे पृष्ठभागीय वाढीच्या विषमतेशी सकारात्मक सहसंबंधित आणि CLV3 अभिव्यक्तीशी नकारात्मक सहसंबंधित होता. टक्केवारी प्रत्येक घटकाद्वारे स्पष्ट केलेली तफावत दर्शवते. d CZ वगळून ऊतींच्या स्तरावर GA सिग्नल, पृष्ठभागीय वाढीची तीव्रता आणि पृष्ठभागीय वाढीची विषमता यांच्यातील स्पीअरमन सहसंबंध विश्लेषण. उजवीकडील संख्या दोन चलांमधील स्पीअरमन रो मूल्य आहे. तारकाचिन्हे (ॲस्टरिस्क) अशी प्रकरणे दर्शवतात जिथे सहसंबंध/नकारात्मक सहसंबंध अत्यंत महत्त्वपूर्ण आहे. e कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपीद्वारे Col-0 SAM L1 पेशींचे 3D दृश्यांकन. १० तासांनी SAM मध्ये (परंतु प्रिमॉर्डियममध्ये नाही) तयार झालेल्या नवीन पेशीभित्ती त्यांच्या कोन मूल्यांनुसार रंगवल्या आहेत. कलर बार खालच्या उजव्या कोपऱ्यात दाखवला आहे. इन्सेटमध्ये ० तासांची संबंधित ३डी प्रतिमा दाखवली आहे. हा प्रयोग दोनदा पुनरावृत्त करण्यात आला आणि परिणाम सारखेच होते. f बॉक्स प्लॉट IPR आणि नॉन-IPR Col-0 SAM मधील पेशी विभाजन दर दर्शवतात (n = १० स्वतंत्र वनस्पती). मध्य रेषा मध्यक दर्शवते, आणि बॉक्सच्या सीमा २५ वे आणि ७५ वे पर्सेन्टाइल दर्शवतात. व्हिस्कर्स R सॉफ्टवेअरने निर्धारित केलेली किमान आणि कमाल मूल्ये दर्शवतात. P मूल्ये वेल्चच्या टू-टेल्ड टी-टेस्टने मिळवली आहेत. g, h योजनाबद्ध आकृती दर्शवते की (g) SAM च्या केंद्रापासून (पांढरी तुटक रेषा) त्रिज्यीय दिशेच्या संदर्भात नवीन पेशीभित्तीचा (मॅजेंटा) कोन कसा मोजावा (केवळ लघुकोन मूल्ये, म्हणजेच ०-९०°, विचारात घेतली आहेत), आणि (h) मेरिस्टेममधील परिघीय/पार्श्व आणि त्रिज्यीय दिशा. i अनुक्रमे SAM (गडद निळा), IPR (मध्यम निळा), आणि नॉन-IPR (फिकट निळा) ओलांडून पेशी विभाजन प्रतलाच्या अभिमुखतेचे वारंवारता हिस्टोग्राम. P मूल्ये द्विपक्षीय कोल्मोगोरोव्ह-स्मिरनोव्ह चाचणीद्वारे मिळवली गेली. हा प्रयोग दोनदा समान परिणामांसह पुनरावृत्त करण्यात आला. j अनुक्रमे P3 (फिकट हिरवा), P4 (मध्यम हिरवा), आणि P5 (गडद हिरवा) च्या भोवती IPR च्या पेशी विभाजन प्रतलाच्या अभिमुखतेचे वारंवारता हिस्टोग्राम. P मूल्ये द्विपक्षीय कोल्मोगोरोव्ह-स्मिरनोव्ह चाचणीद्वारे मिळवली गेली. हा प्रयोग दोनदा समान परिणामांसह पुनरावृत्त करण्यात आला.
म्हणून, आम्ही पुढे चाचणीदरम्यान नव्याने तयार झालेल्या पेशीभित्ती ओळखून GA सिग्नलिंग आणि पेशी विभाजन क्रियेमधील सहसंबंधाचा तपास केला (आकृती 5e). या पद्धतीमुळे आम्हाला पेशी विभाजनाची वारंवारता आणि दिशा मोजता आली. आश्चर्याची गोष्ट म्हणजे, आम्हाला आढळले की IPR आणि SAM च्या उर्वरित भागातील (नॉन-IPR, आकृती 5f) पेशी विभाजनाची वारंवारता समान होती, जे दर्शवते की IPR आणि नॉन-IPR पेशींमधील GA सिग्नलिंगमधील फरक पेशी विभाजनावर लक्षणीय परिणाम करत नाहीत. यामुळे, आणि GA सिग्नलिंग व वाढीच्या विषमदिक्तेमधील सकारात्मक सहसंबंधामुळे, आम्हाला असा विचार करण्यास प्रवृत्त केले की GA सिग्नलिंग क्रिया पेशी विभाजन प्रतलाच्या अभिमुखतेवर प्रभाव टाकू शकते का. आम्ही मेरिस्टेम केंद्र आणि नवीन पेशीभित्तीच्या केंद्राला जोडणाऱ्या त्रिज्यीय अक्षाच्या सापेक्ष, नवीन पेशीभित्तीची अभिविन्यास एक लघुकोन म्हणून मोजली (आकृती ५इ-झ) आणि असे निरीक्षण केले की पेशींमध्ये त्रिज्यीय अक्षाच्या सापेक्ष ९०° च्या जवळच्या कोनांवर विभाजन होण्याची स्पष्ट प्रवृत्ती होती, ज्यामध्ये ७०-८०° (२३.२८%) आणि ८०-९०° (२२.६२%) वर सर्वाधिक वारंवारता आढळली (आकृती ५इ,इ), जे परिघीय/आडव्या दिशेतील पेशी विभाजनांशी संबंधित आहे (आकृती ५ह). या पेशी विभाजन वर्तनामध्ये जीए सिग्नलिंगचे योगदान तपासण्यासाठी, आम्ही आयपीआर आणि नॉन-आयपीआर मधील पेशी विभाजन पॅरामीटर्सचे स्वतंत्रपणे विश्लेषण केले (आकृती ५इ). आम्ही असे निरीक्षण केले की IPR पेशींमधील विभाजन कोनाचे वितरण हे नॉन-IPR पेशी किंवा संपूर्ण SAM मधील पेशींपेक्षा वेगळे होते, ज्यात IPR पेशींमध्ये पार्श्व/वर्तुळाकार पेशी विभाजनांचे प्रमाण जास्त होते, म्हणजेच ७०-८०° आणि ८०-९०° (अनुक्रमे ३३.८६% आणि ३०.७१% संबंधित प्रमाण) (आकृती ५i). अशाप्रकारे, आमच्या निरीक्षणातून उच्च GA सिग्नलिंग आणि परिघीय दिशेच्या जवळ असलेल्या पेशी विभाजन प्रतलाच्या अभिमुखतेमध्ये संबंध असल्याचे दिसून आले, जे GA सिग्नलिंग क्रियाकलाप आणि वाढीच्या विषमदिक्तेमधील सहसंबंधासारखेच आहे (आकृती ५c, d). या संबंधाचे अवकाशीय संवर्धन अधिक स्थापित करण्यासाठी, आम्ही P3 पासून सुरू होणाऱ्या प्रिमॉर्डियमच्या सभोवतालच्या IPR पेशींमधील विभाजन प्रतलाची अभिमुखता मोजली, कारण P4 पासून या प्रदेशात सर्वाधिक GA सिग्नलिंग क्रियाकलाप आढळला होता (आकृती ४). P3 आणि P4 च्या आसपासच्या IPR च्या विभाजन कोनांमध्ये सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण फरक आढळला नाही, जरी P4 च्या आसपासच्या IPR मध्ये पार्श्व पेशी विभाजनांची वाढलेली वारंवारता दिसून आली (आकृती ५j). तथापि, P5 च्या आसपासच्या IPR पेशींमध्ये, पेशी विभाजन प्रतलाच्या अभिमुखतेमधील फरक सांख्यिकीयदृष्ट्या लक्षणीय बनला, ज्यामध्ये आडव्या पेशी विभाजनांच्या वारंवारतेत तीव्र वाढ झाली (आकृती 5j). एकत्रितपणे, हे परिणाम सूचित करतात की GA सिग्नलिंग SAM मधील पेशी विभाजनांची अभिमुखता नियंत्रित करू शकते, जे मागील अहवालांशी सुसंगत आहे40,41 की उच्च GA सिग्नलिंग IPR मध्ये पेशी विभाजनांची पार्श्व अभिमुखता प्रेरित करू शकते.
असा अंदाज आहे की IPR मधील पेशी प्रिमॉर्डीयामध्ये समाविष्ट न होता इंटरनोड्समध्ये समाविष्ट होतील²,⁴²,⁴³. IPR मधील पेशी विभाजनाच्या आडव्या दिशेमुळे इंटरनोड्समध्ये एपिडर्मल पेशींच्या समांतर उभ्या रांगांची वैशिष्ट्यपूर्ण रचना होऊ शकते. वर वर्णन केलेली आमची निरीक्षणे सूचित करतात की पेशी विभाजनाची दिशा नियंत्रित करून GA सिग्नलिंग या प्रक्रियेत भूमिका बजावते.
अनेक DELLA जनुकांच्या कार्याचा लोप झाल्यामुळे एक सातत्यपूर्ण GA प्रतिसाद मिळतो, आणि या गृहितकाची चाचणी घेण्यासाठी डेला म्युटंट्सचा वापर केला जाऊ शकतो⁴⁴. आम्ही सर्वप्रथम SAM मध्ये पाच DELLA जनुकांच्या अभिव्यक्तीच्या पद्धतींचे विश्लेषण केले. GUS लाइनच्या⁴⁵ ट्रान्सक्रिप्शनल फ्यूजनने हे उघड केले की GAI, RGA, RGL1, आणि RGL2 (खूप कमी प्रमाणात) SAM मध्ये अभिव्यक्त झाले होते (पूरक आकृती 11a–d). इन सिटू हायब्रिडायझेशनने पुढे हे दाखवून दिले की GAI mRNA विशेषतः प्रिमॉर्डीया आणि विकसित होणाऱ्या फुलांमध्ये जमा होतो (पूरक आकृती 11e). RGL1 आणि RGL3 mRNA संपूर्ण SAM कॅनोपीमध्ये आणि जुन्या फुलांमध्ये आढळले, तर RGL2 mRNA सीमावर्ती प्रदेशात अधिक प्रमाणात होता (पूरक आकृती 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM च्या कॉन्फोकल इमेजिंगने इन सिटू हायब्रिडायझेशनद्वारे निरीक्षण केलेल्या अभिव्यक्तीची पुष्टी केली आणि दाखवले की RGL3 प्रथिन SAM च्या मध्यवर्ती भागात जमा होते (पूरक आकृती 11i). pRGA::GFP-RGA लाइन वापरून, आम्हाला असेही आढळले की RGA प्रथिन SAM मध्ये जमा होते, परंतु P4 पासून सीमेवर त्याचे प्रमाण कमी होते (पूरक आकृती 11j). विशेष म्हणजे, RGL3 आणि RGA चे अभिव्यक्ती नमुने, qmRGA द्वारे शोधलेल्या IPR मधील उच्च GA सिग्नलिंग क्रियाकलापांशी सुसंगत आहेत (आकृती 4). शिवाय, हा डेटा सूचित करतो की सर्व DELLAs SAM मध्ये अभिव्यक्त होतात आणि त्यांची एकत्रित अभिव्यक्ती संपूर्ण SAM मध्ये पसरलेली आहे.
यानंतर आम्ही वाइल्ड-टाइप SAM (Ler, नियंत्रण) आणि gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 डेला क्विंटपल (ग्लोबल) म्युटंट्समधील पेशी विभाजन पॅरामीटर्सचे विश्लेषण केले (आकृती 6a, b). विशेष म्हणजे, वाइल्ड-टाइपच्या तुलनेत डेला ग्लोबल म्युटंट SAM मध्ये पेशी विभाजन कोन वारंवारतेच्या वितरणात आम्हाला एक सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण बदल आढळला (आकृती 6c). डेला ग्लोबल म्युटंटमधील हा बदल 80–90° कोनांच्या वारंवारतेत (34.71% विरुद्ध 24.55%) आणि काही प्रमाणात 70–80° कोनांच्या वारंवारतेत (23.78% विरुद्ध 20.18%) वाढ झाल्यामुळे होता, म्हणजेच, जे आडव्या पेशी विभाजनांशी संबंधित आहेत (आकृती 6c). डेला ग्लोबल म्युटंटमध्ये आडव्या नसलेल्या विभाजनांची (0–60°) वारंवारता देखील कमी होती (आकृती 6c). डेला ग्लोबल म्युटंटच्या SAM मध्ये आडव्या पेशी विभाजनांची वारंवारता लक्षणीयरीत्या वाढली होती (आकृती 6b). वाइल्ड टाइपच्या तुलनेत डेला ग्लोबल म्युटंटमध्ये IPR मधील आडव्या पेशी विभाजनांची वारंवारता देखील जास्त होती (आकृती 6d). IPR क्षेत्राच्या बाहेर, वाइल्ड टाइपमध्ये पेशी विभाजन कोनांचे वितरण अधिक एकसमान होते, तर डेला ग्लोबल म्युटंटने IPR प्रमाणे स्पर्शरेषीय विभाजनांना प्राधान्य दिले (आकृती 6e). आम्ही ga2 ऑक्सिडेस (ga2ox) क्विन्टपल म्युटंट्सच्या (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, आणि ga2ox6-2) SAM मधील पेशी विभाजनांच्या अभिमुखतेचे देखील परिमाणीकरण केले, जे एक GA-निष्क्रिय म्युटंट बॅकग्राउंड आहे ज्यात GA जमा होतो. जीए (GA) पातळीतील वाढीनुसार, पंचक ga2ox उत्परिवर्ती पुष्पगुच्छाचा एसएएम (SAM) हा Col-0 पेक्षा मोठा होता (पूरक आकृती 12a, b), आणि Col-0 च्या तुलनेत, पंचक ga2ox एसएएमने पेशी विभाजन कोनांचे एक वेगळेच वितरण दर्शवले, ज्यात कोनांची वारंवारता 50° ते 90° पर्यंत वाढत होती, म्हणजेच पुन्हा स्पर्शरेषीय विभाजनांना अनुकूलता दर्शवत होती (पूरक आकृती 12a–c). अशाप्रकारे, आम्ही दाखवतो की जीए सिग्नलिंगचे सातत्यपूर्ण सक्रियकरण आणि जीए संचय हे आयपीआर (IPR) आणि उर्वरित एसएएममध्ये पार्श्व पेशी विभाजनांना प्रेरित करतात.
a, b कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपी वापरून PI-स्टेन्ड लेर (a) आणि ग्लोबल डेला म्युटंट (b) SAM च्या L1 थराचे 3D व्हिज्युअलायझेशन. 10 तासांच्या कालावधीत SAM मध्ये (परंतु प्रिमॉर्डियममध्ये नाही) तयार झालेल्या नवीन पेशीभित्ती दर्शविल्या आहेत आणि त्यांच्या कोन मूल्यांनुसार रंगविल्या आहेत. इन्सेटमध्ये 0 तासांचे SAM दर्शविले आहे. कलर बार खालच्या उजव्या कोपऱ्यात दर्शविला आहे. (b) मधील बाण ग्लोबल डेला म्युटंटमधील संरेखित पेशी रांगांचे उदाहरण दर्शवतो. हा प्रयोग दोनदा पुनरावृत्त करण्यात आला आणि परिणाम सारखेच होते. ce लेर आणि ग्लोबल डेला यांच्यातील संपूर्ण SAM (d), IPR (e), आणि नॉन-IPR (f) मधील पेशी विभाजन प्रतलाच्या अभिमुखतेच्या वारंवारता वितरणाची तुलना. P मूल्ये द्विपक्षीय कोल्मोगोरोव्ह-स्मिरनोव्ह चाचणी वापरून मिळवली गेली. f, g Col-0 (i) आणि pCUC2::gai-1-VENUS (j) या जनुकीय बदल केलेल्या वनस्पतींच्या PI-रंगवलेल्या SAM च्या कॉन्फोकल प्रतिमांचे त्रिमितीय दृश्यांकन. पॅनेल (a, b) मध्ये 10 तासांच्या आत SAM मध्ये तयार झालेल्या नवीन पेशीभित्ती (परंतु आदिपेशी नाहीत) दर्शविल्या आहेत. हा प्रयोग दोनदा पुनरावृत्त करण्यात आला आणि परिणाम सारखेच होते. h–j Col-0 आणि pCUC2::gai-1-VENUS वनस्पतींमधील संपूर्ण SAM (h), IPR (i) आणि नॉन-IPR (j) मध्ये असलेल्या पेशी विभाजन प्रतलांच्या अभिमुखतेच्या वारंवारता वितरणाची तुलना. P मूल्ये द्विपक्षीय कोल्मोगोरोव्ह-स्मिरनोव्ह चाचणी वापरून मिळवली गेली.
यानंतर आम्ही विशेषतः IPR मध्ये GA सिग्नलिंग रोखण्याचा परिणाम तपासला. यासाठी, आम्ही VENUS शी जोडलेल्या डोमिनंट निगेटिव्ह gai-1 प्रोटीनची अभिव्यक्ती (pCUC2::gai-1-VENUS लाइनमध्ये) चालवण्यासाठी कॉटिलिडॉन कप 2 (CUC2) प्रमोटरचा वापर केला. वाइल्ड-टाइप SAM मध्ये, CUC2 प्रमोटर P4 पासून पुढे बॉर्डर सेल्ससह SAM मधील बहुतेक IPRs ची अभिव्यक्ती चालवतो, आणि अशीच विशिष्ट अभिव्यक्ती pCUC2::gai-1-VENUS वनस्पतींमध्येही दिसून आली (खाली पहा). pCUC2::gai-1-VENUS वनस्पतींच्या SAM किंवा IPR मधील पेशी विभाजन कोनांचे वितरण वाइल्ड-टाइपपेक्षा लक्षणीयरीत्या वेगळे नव्हते, तरीही अनपेक्षितपणे आम्हाला आढळले की या वनस्पतींमधील IPR नसलेल्या पेशी 80–90° च्या उच्च वारंवारतेने विभाजित झाल्या (आकृती 6f–j).
असे सुचविण्यात आले आहे की पेशी विभाजनाची दिशा SAM च्या भूमितीवर, विशेषतः ऊतींच्या वक्रतेमुळे निर्माण होणाऱ्या ताणतणावावर अवलंबून असते46. म्हणून आम्ही तपासले की डेला ग्लोबल म्युटंट आणि pCUC2::gai-1-VENUS वनस्पतींमध्ये SAM चा आकार बदलला होता का. पूर्वी नोंदवल्याप्रमाणे12, डेला ग्लोबल म्युटंट SAM चा आकार वाइल्ड टाइपपेक्षा मोठा होता (पूरक आकृती 13a, b, d). CLV3 आणि STM RNA च्या इन सिटू हायब्रिडायझेशनने डेला म्युटंट्समध्ये मेरिस्टेमच्या विस्ताराची पुष्टी केली आणि पुढे स्टेम सेल निकेशचा बाजूकडील विस्तार दर्शविला (पूरक आकृती 13e, f, h, i). तथापि, दोन्ही जीनोटाइपमध्ये SAM ची वक्रता समान होती (पूरक आकृती 13k, m, n, p). वाईल्ड टाईपच्या तुलनेत, gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 डेला क्वाड्रपल म्युटंटमध्ये वक्रतेत कोणताही बदल न होता आकारात अशीच वाढ झाल्याचे आम्ही पाहिले (पूरक आकृती १३c, d, g, j, l, o, p). डेला क्वाड्रपल म्युटंटमध्ये पेशी विभाजनाच्या अभिमुखतेच्या वारंवारतेवरही परिणाम झाला होता, परंतु डेला मोनोलिथिक म्युटंटच्या तुलनेत तो कमी प्रमाणात होता (पूरक आकृती १२d–f). हा डोसेज परिणाम, वक्रतेवरील परिणामाच्या अभावासह, असे सूचित करतो की डेला क्वाड्रपल म्युटंटमधील अवशिष्ट RGL3 क्रियाशीलता, DELLA क्रियाशीलतेच्या कमतरतेमुळे होणाऱ्या पेशी विभाजनाच्या अभिमुखतेतील बदलांना मर्यादित करते आणि पार्श्व पेशी विभाजनातील बदल हे SAM भूमितीतील बदलांऐवजी GA सिग्नलिंग क्रियाशीलतेतील बदलांच्या प्रतिसादात होतात. वर वर्णन केल्याप्रमाणे, CUC2 प्रमोटर P4 पासून SAM मध्ये IPR अभिव्यक्तीला चालना देतो (पूरक आकृती 14a, b), आणि याउलट, pCUC2::gai-1-VENUS SAM चा आकार कमी होता पण वक्रता जास्त होती (पूरक आकृती 14c–h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM च्या आकारशास्त्रातील या बदलामुळे वाइल्ड टाइपच्या तुलनेत यांत्रिक ताणांचे वितरण वेगळे असू शकते, ज्यामध्ये उच्च परिघीय ताण SAM केंद्रापासून कमी अंतरावर सुरू होतात47. पर्यायाने, pCUC2::gai-1-VENUS SAM च्या आकारशास्त्रातील बदल ट्रान्सजीन अभिव्यक्तीमुळे प्रेरित प्रादेशिक यांत्रिक गुणधर्मांमधील बदलांमुळे होऊ शकतात48. दोन्ही बाबतीत, यामुळे GA सिग्नलिंगमधील बदलांचे परिणाम अंशतः कमी होऊ शकतात, कारण यामुळे पेशी परिघीय/आडव्या दिशेने विभाजित होण्याची शक्यता वाढते, जे आमच्या निरीक्षणांचे स्पष्टीकरण देते.
एकत्रितपणे, आमचा डेटा याची पुष्टी करतो की उच्च GA सिग्नलिंग IPR मधील पेशी विभाजन प्रतलाच्या पार्श्व अभिमुखतेमध्ये सक्रिय भूमिका बजावते. तो हे देखील दाखवतो की मेरिस्टेमची वक्रता देखील IPR मधील पेशी विभाजन प्रतलाच्या अभिमुखतेवर प्रभाव टाकते.
उच्च GA सिग्नलिंग क्रियेमुळे IPR मधील विभाजन प्रतलाची आडवी मांडणी, असे सूचित करते की GA, SAM च्या आत बाह्यत्वचेमध्ये एक त्रिज्यीय पेशी रांग पूर्व-संघटित करते, जेणेकरून नंतर बाह्यत्वचेच्या आंतरगाठीमध्ये आढळणारी पेशीय रचना निश्चित करता येईल. खरंच, डेला ग्लोबल म्युटंट्सच्या SAM प्रतिमांमध्ये अशा पेशी रांगा वारंवार दृश्यमान होत्या (आकृती 6b). म्हणून, SAM मधील GA सिग्नलिंगच्या अवकाशीय रचनेच्या विकासात्मक कार्याचा अधिक शोध घेण्यासाठी, आम्ही वाइल्ड-टाइप (Ler आणि Col-0), डेला ग्लोबल म्युटंट्स आणि pCUC2::gai-1-VENUS ट्रान्सजेनिक वनस्पतींमधील IPR मधील पेशींच्या अवकाशीय रचनेचे विश्लेषण करण्यासाठी टाइम-लॅप्स इमेजिंगचा वापर केला.
आम्हाला आढळले की qmRGA ने दाखवले की IPR मधील GA सिग्नलिंग क्रियाकलाप P1/P2 पासून वाढला आणि P4 ला सर्वोच्च पातळीवर पोहोचला, आणि हा नमुना कालांतराने स्थिर राहिला (आकृती 4a–f आणि पूरक आकृती 8c–f, k). वाढत्या GA सिग्नलसह IPR मधील पेशींच्या अवकाशीय रचनेचे विश्लेषण करण्यासाठी, आम्ही पहिल्या निरीक्षणाच्या 34 तासांनंतर, म्हणजेच दोन प्लास्टिड वेळेपेक्षा जास्त, विश्लेषण केलेल्या त्यांच्या विकासात्मक भवितव्यानुसार P4 च्या वर आणि बाजूला असलेल्या Ler IPR पेशींना लेबल केले, ज्यामुळे आम्हाला P1/P2 पासून P4 पर्यंत प्रिमॉर्डियमच्या विकासादरम्यान IPR पेशींचा मागोवा घेता आला. आम्ही तीन वेगवेगळे रंग वापरले: P4 जवळ प्रिमॉर्डियममध्ये एकत्रित झालेल्या पेशींसाठी पिवळा, IPR मध्ये असलेल्या पेशींसाठी हिरवा, आणि दोन्ही प्रक्रियांमध्ये सहभागी झालेल्या पेशींसाठी जांभळा (आकृती 7a–c). t0 (0 तास) वेळी, P4 च्या समोर IPR पेशींचे 1-2 थर दिसत होते (आकृती 7a). अपेक्षेप्रमाणे, जेव्हा या पेशींचे विभाजन झाले, तेव्हा ते प्रामुख्याने आडव्या विभाजन प्रतलाद्वारे झाले (आकृती ७अ–क). Col-0 SAM वापरूनही असेच परिणाम मिळाले (P3 वर लक्ष केंद्रित करून, ज्याची सीमा Ler मधील P4 प्रमाणेच वळते), जरी या जनुकीय प्रकारात फुलाच्या सीमेवर तयार झालेल्या घडीने IPR पेशींना अधिक लवकर लपवले (आकृती ७ग–झ). अशाप्रकारे, IPR पेशींची विभाजन पद्धत, आंतरपर्वांप्रमाणे, पेशींना त्रिज्यीय रांगांमध्ये पूर्व-संघटित करते. त्रिज्यीय रांगांची रचना आणि एकामागून एक येणाऱ्या अवयवांमध्ये IPR पेशींचे स्थानिकीकरण हे सूचित करते की या पेशी आंतरपर्वीय पूर्वज पेशी आहेत.
येथे, आम्ही एक रॅटिओमेट्रिक जीए सिग्नलिंग बायोसेन्सर, qmRGA, विकसित केला आहे, जो अंतर्गत सिग्नलिंग मार्गांमधील हस्तक्षेप कमी करून, एकत्रित जीए आणि जीए रिसेप्टर सांद्रतेमुळे होणाऱ्या जीए सिग्नलिंग क्रियेचे परिमाणात्मक मॅपिंग करण्यास अनुमती देतो, ज्यामुळे पेशीय स्तरावर जीए कार्याबद्दल माहिती मिळते. यासाठी, आम्ही एक सुधारित डेला प्रोटीन, mRGA, तयार केले, ज्याने डेला इंटरॅक्शन पार्टनर्सना बांधण्याची क्षमता गमावली आहे, परंतु ते जीए-प्रेरित प्रोटिओलायसिससाठी संवेदनशील राहते. qmRGA जीए पातळीतील बाह्य आणि अंतर्गत दोन्ही बदलांना प्रतिसाद देतो, आणि त्याचे गतिशील संवेदन गुणधर्म विकासादरम्यान जीए सिग्नलिंग क्रियेतील अवकाशीय-कालिक बदलांचे मूल्यांकन करण्यास सक्षम करतात. qmRGA हे एक अतिशय लवचिक साधन देखील आहे कारण त्याच्या अभिव्यक्तीसाठी वापरलेला प्रमोटर (आवश्यक असल्यास) बदलून ते वेगवेगळ्या ऊतींशी जुळवून घेतले जाऊ शकते, आणि आवृत्तबीज वनस्पतींमध्ये जीए सिग्नलिंग मार्ग आणि PFYRE मोटिफचे संरक्षित स्वरूप पाहता, ते इतर प्रजातींमध्ये हस्तांतरणीय असण्याची शक्यता आहे²². याला अनुसरून, भाताच्या SLR1 DELLA प्रथिनामधील एक समतुल्य उत्परिवर्तन (HYY497AAA) देखील SLR1 ची वाढ रोखणारी क्रियाशीलता दडपते आणि mRGA23 प्रमाणेच, त्याचे GA-मध्यस्थी क्षरण केवळ किंचित कमी करते असे दिसून आले. विशेष म्हणजे, अ‍ॅरेबिडॉप्सिसमधील अलीकडील अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की PFYRE डोमेनमधील एकाच अमिनो आम्लाच्या उत्परिवर्तनाने (S474L) RGA ची ट्रान्सक्रिप्शनल क्रियाशीलता बदलली, परंतु ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर भागीदारांशी संवाद साधण्याच्या त्याच्या क्षमतेवर परिणाम झाला नाही50. जरी हे उत्परिवर्तन mRGA मध्ये असलेल्या 3 अमिनो आम्ल प्रतिस्थापनांच्या अगदी जवळ असले तरी, आमचे अभ्यास दर्शवतात की ही दोन उत्परिवर्तने DELLA ची भिन्न वैशिष्ट्ये बदलतात. जरी बहुतेक ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर भागीदार DELLA26,51 च्या LHR1 आणि SAW डोमेनला बांधले जातात, तरी PFYRE डोमेनमधील काही संरक्षित अमिनो आम्ले या आंतरक्रिया स्थिर करण्यास मदत करू शकतात.
आंतरगाठींचा विकास हा वनस्पतीची रचना आणि उत्पन्न सुधारणेमधील एक महत्त्वाचा गुणधर्म आहे. qmRGA ने IPR आंतरगाठीच्या पूर्वज पेशींमध्ये उच्च GA सिग्नलिंग क्रियाशीलता उघड केली. परिमाणात्मक इमेजिंग आणि जनुकीयशास्त्र यांचा संयोग करून, आम्ही दाखवून दिले की GA सिग्नलिंग नमुने SAM बाह्यत्वचेमध्ये वर्तुळाकार/आडव्या पेशी विभाजन प्रतलांना एकमेकांवर आच्छादित करतात, ज्यामुळे आंतरगाठींच्या विकासासाठी आवश्यक असलेल्या पेशी विभाजन रचनेला आकार मिळतो. विकासादरम्यान पेशी विभाजन प्रतलाच्या अभिमुखतेचे अनेक नियामक ओळखले गेले आहेत५२,५३. आमचे कार्य GA सिग्नलिंग क्रियाशीलता या पेशीय मापदंडाचे नियमन कसे करते याचे एक स्पष्ट उदाहरण प्रदान करते. DELLA प्रीफोल्डिंग प्रथिन संकुलांशी आंतरक्रिया करू शकते४१, त्यामुळे GA सिग्नलिंग थेट कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल अभिमुखतेवर प्रभाव टाकून पेशी विभाजन प्रतलाच्या अभिमुखतेचे नियमन करू शकते४०,४१,५४,५५. आम्ही अनपेक्षितपणे दाखवून दिले की SAM मध्ये, उच्च GA सिग्नलिंग क्रियाशीलतेचा सहसंबंध पेशींचे लांबणे किंवा विभाजन नसून, केवळ वाढीतील विषमदिक्ता (ग्रोथ ॲनायसोट्रॉपी) होता, जे IPR मधील पेशी विभाजनाच्या दिशेवर GA च्या थेट परिणामाशी सुसंगत आहे. तथापि, आम्ही हे नाकारू शकत नाही की हा परिणाम अप्रत्यक्ष देखील असू शकतो, उदाहरणार्थ GA-प्रेरित पेशीभित्तीच्या मृदूकरणामुळे५६. पेशीभित्तीच्या गुणधर्मांमधील बदलांमुळे यांत्रिक ताण निर्माण होतो५७,५८, जो कॉर्टिकल मायक्रोट्यूब्यूल्सच्या अभिमुखतेवर परिणाम करून पेशी विभाजन प्रतलाच्या अभिमुखतेवर देखील प्रभाव टाकू शकतो३९,४६,५९. GA-प्रेरित यांत्रिक ताण आणि GA द्वारे मायक्रोट्यूब्यूल अभिमुखतेचे थेट नियमन यांचे एकत्रित परिणाम, आंतरगाठी निश्चित करण्यासाठी IPR मध्ये पेशी विभाजन अभिमुखतेचा एक विशिष्ट नमुना तयार करण्यात सामील असू शकतात, आणि या कल्पनेची चाचणी घेण्यासाठी पुढील अभ्यासांची आवश्यकता आहे. त्याचप्रमाणे, मागील अभ्यासांनी आंतरगाठींच्या निर्मितीच्या नियंत्रणामध्ये DELLA-इंटरॅक्टिंग प्रथिने TCP14 आणि 15 यांचे महत्त्व अधोरेखित केले आहे६०,६१ आणि हे घटक BREVIPEDICELLUS (BP) आणि PENNYWISE (PNY) यांच्यासोबत GA च्या क्रियेत मध्यस्थी करू शकतात, जे आंतरगाठींच्या विकासाचे नियमन करतात आणि GA सिग्नलिंगवर प्रभाव टाकतात असे दिसून आले आहे२,६२. डेला हे ब्रासिनोस्टेरॉइड, इथिलीन, जॅस्मोनिक ऍसिड आणि ऍब्सिसिक ऍसिड (एबीए) सिग्नलिंग मार्गांशी संवाद साधतात आणि हे हार्मोन्स मायक्रोट्यूब्यूल ओरिएंटेशनवर प्रभाव टाकू शकतात हे लक्षात घेता, पेशी विभाजन ओरिएंटेशनवरील जीएचे परिणाम इतर हार्मोन्सद्वारे देखील मध्यस्थी केले जाऊ शकतात.
सुरुवातीच्या पेशीशास्त्रीय अभ्यासातून असे दिसून आले की अ‍ॅरेबिडॉप्सिस SAM चे आतील आणि बाहेरील दोन्ही भाग कांड्यांच्या विकासासाठी आवश्यक आहेत²,⁴². GA आतील ऊतींमध्ये पेशी विभाजनाचे सक्रियपणे नियमन करते¹² ही वस्तुस्थिती, SAM मध्ये मेरिस्टेम आणि कांड्यांचा आकार नियंत्रित करण्याच्या GA च्या दुहेरी कार्याला समर्थन देते. दिशात्मक पेशी विभाजनाचा नमुना देखील आतील SAM ऊतीमध्ये काटेकोरपणे नियंत्रित केला जातो आणि हे नियमन खोडाच्या वाढीसाठी आवश्यक आहे⁵². GA आतील SAM रचनेत पेशी विभाजनाच्या प्रतलाला दिशा देण्यात देखील भूमिका बजावते का, आणि त्याद्वारे SAM मधील कांड्यांचे वैशिष्ट्यीकरण आणि विकास समक्रमित करते का, हे तपासणे मनोरंजक ठरेल.
अधोबीजपत्र (हायपोकॉटिल) आणि मुळांच्या वाढीच्या प्रयोगांव्यतिरिक्त, वनस्पतींची वाढ इन विट्रो पद्धतीने मातीत किंवा १% सुक्रोज आणि १% आगर (सिग्मा) मिसळलेल्या १x मुराशीगे-स्कूग (एमएस) माध्यमात (डुचेफा) प्रमाणित परिस्थितीत (१६ तास प्रकाश, २२°C) करण्यात आली; अधोबीजपत्र आणि मुळांच्या वाढीच्या प्रयोगांमध्ये रोपांची वाढ उभ्या प्लेट्सवर सतत प्रकाश आणि २२°C तापमानात करण्यात आली. नायट्रेटच्या प्रयोगांसाठी, वनस्पतींची वाढ सुधारित एमएस माध्यमावर (बायोवर्ल्ड वनस्पती माध्यम) करण्यात आली, ज्यात पुरेसे नायट्रेट (० किंवा १० mM KNO3), ०.५ mM NH4-सक्सिनेट, १% सुक्रोज आणि १% ए-आगर (सिग्मा) मिसळलेले होते आणि ही वाढ दीर्घ-दिवसांच्या परिस्थितीत करण्यात आली.
pDONR221 मध्ये घातलेल्या GID1a cDNA चे, pDONR P4-P1R-pUBQ10 आणि pDONR P2R-P3-mCherry सोबत pB7m34GW मध्ये पुनर्संयोजन करून pUBQ10::GID1a-mCherry तयार करण्यात आले. pDONR221 मध्ये घातलेल्या IDD2 DNA चे, pB7RWG266 मध्ये पुनर्संयोजन करून p35S:IDD2-RFP तयार करण्यात आले. pGID1b::2xmTQ2-GID1b तयार करण्यासाठी, GID1b कोडिंग क्षेत्राच्या वरच्या बाजूला असलेला 3.9 kb चा तुकडा आणि GID1b cDNA (1.3 kb) व टर्मिनेटर (3.4 kb) असलेला 4.7 kb चा तुकडा, हे प्रथम पूरक सारणी 3 मधील प्राइमर वापरून ॲम्प्लिफाय करण्यात आले आणि नंतर अनुक्रमे pDONR P4-P1R (थर्मो फिशर सायंटिफिक) आणि pDONR P2R-P3 (थर्मो फिशर सायंटिफिक) मध्ये समाविष्ट करण्यात आले, आणि शेवटी गेटवे क्लोनिंग वापरून pDONR221 2xmTQ268 सह pGreen 012567 लक्ष्य व्हेक्टरमध्ये पुनर्संयोजित करण्यात आले. pCUC2::LSSmOrange तयार करण्यासाठी, CUC2 प्रमोटर सिक्वेन्स (ATG च्या ३२२९ bp अपस्ट्रीम), त्यानंतर N7 न्यूक्लियर लोकलायझेशन सिग्नल आणि NOS ट्रान्सक्रिप्शनल टर्मिनेटरसह लार्ज स्टोक्स-शिफ्टेड mOrange (LSSmOrange)69 चा कोडिंग सिक्वेन्स, यांना गेटवे ३-फ्रॅगमेंट रिकॉम्बिनेशन सिस्टीम (Invitrogen) वापरून pGreen कॅनामायसिन टार्गेटिंग व्हेक्टरमध्ये एकत्र जोडण्यात आले. हा वनस्पती बायनरी व्हेक्टर, अनुक्रमे ॲग्रोबॅक्टेरियम इन्फिल्ट्रेशन पद्धतीने ॲग्रोबॅक्टेरियम ट्युमेफॅसिएन्स स्ट्रेन GV3101 मध्ये आणि निकोटियाना बेंथॅमियानाच्या पानांमध्ये, तसेच फ्लोरल डिप पद्धतीने ॲराबिडॉप्सिस थॅलियाना Col-0 मध्ये समाविष्ट करण्यात आला. pUBQ10::qmRGA, pUBQ10::GID1a-mCherry आणि pCLV3::mCherry-NLS qmRGA हे अनुक्रमे संबंधित क्रॉसच्या F3 आणि F1 संततीमधून वेगळे करण्यात आले.
सुमारे १ सेमी लांब शूट टिप्स७२ वर आरएनए इन सिटू हायब्रिडायझेशन केले गेले, जे गोळा करून ४°C पर्यंत पूर्व-थंड केलेल्या एफएए द्रावणात (३.७% फॉर्मल्डिहाइड, ५% ऍसिटिक ऍसिड, ५०% इथेनॉल) त्वरित स्थिर केले गेले. २ × १५ मिनिटांच्या व्हॅक्यूम उपचारांनंतर, फिक्सेटिव्ह बदलण्यात आले आणि नमुने रात्रभर इनक्युबेट केले गेले. रोझियर एट अल.७३ यांनी वर्णन केल्यानुसार, पूरक सारणी ३ मध्ये दर्शविलेल्या प्रायमर्सचा वापर करून GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, आणि RGL3 cDNAs आणि त्यांच्या ३′-UTRs साठी अँटीसेन्स प्रोब्स संश्लेषित केले गेले. डायजॉक्सिजेनिन-लेबल केलेले प्रोब्स डायजॉक्सिजेनिन अँटीबॉडीज (3000-पट डायल्यूशन; रोश, कॅटलॉग क्रमांक: 11 093 274 910) वापरून इम्युनोडिटेक्ट केले गेले आणि सेक्शन्सना 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिल फॉस्फेट (BCIP, 250-पट डायल्यूशन)/नायट्रोब्यू टेट्राझोलियम (NBT, 200-पट डायल्यूशन) सोल्यूशनने रंगवले गेले.