जंतुनाशक औषध N,N-डायथिल-एम-टोलुआमाइड (डीईईटी) AChE (एसिटाइलकोलिनेस्टेरेस) प्रतिबंधित करते आणि जास्त रक्तवहिन्यामुळे संभाव्य कार्सिनोजेनिक गुणधर्म आहेत असे नोंदवले गेले आहे. या पेपरमध्ये, आम्ही दाखवतो की DEET विशेषतः एंजियोजेनेसिसला चालना देणाऱ्या एंडोथेलियल पेशींना उत्तेजित करते, ज्यामुळे ट्यूमरची वाढ वाढते. DEET एंजियोजेनेसिसकडे नेणाऱ्या सेल्युलर प्रक्रिया सक्रिय करते, ज्यामध्ये प्रसार, स्थलांतर आणि आसंजन यांचा समावेश आहे. हे एंडोथेलियल पेशींमध्ये NO उत्पादन आणि VEGF अभिव्यक्ती वाढण्याशी संबंधित आहे. M3 ला शांत करणे किंवा फार्माकोलॉजिकल M3 इनहिबिटर वापरणे हे सर्व परिणाम रद्द करते, असे सूचित करते की DEET-प्रेरित एंजियोजेनेसिस M3-संवेदनशील आहे. एंडोथेलियल आणि HEK पेशींमध्ये कॅल्शियम सिग्नलिंगचा समावेश असलेले प्रयोग, M3 रिसेप्टर्सचे अॅलोस्टेरिक मॉड्युलेटर म्हणून कार्य करते, तसेच बंधनकारक आणि डॉकिंग अभ्यास सूचित करतात की DEET M3 रिसेप्टर्सचे अॅलोस्टेरिक मॉड्युलेटर म्हणून कार्य करते. शिवाय, DEET AChE ला प्रतिबंधित करते, ज्यामुळे अॅसिटाइलकोलिनची जैवउपलब्धता आणि M3 रिसेप्टर्सशी त्याचे बंधन वाढते आणि अॅलोस्टेरिक नियमनाद्वारे प्रोएंजियोजेनिक प्रभाव वाढवते.
स्विस उंदरांच्या महाधमनीपासून प्राथमिक ईसी वेगळे केले गेले. कोबायाशी प्रोटोकॉल 26 मधून निष्कर्षण पद्धत स्वीकारली गेली. चौथ्या उतारापर्यंत 5% उष्णता-निष्क्रिय एफबीएससह पूरक असलेल्या ईबीएम-2 माध्यमात म्युरिन ईसीचे संवर्धन केले गेले.
HUVEC, U87MG, किंवा BF16F10 च्या प्रसारावर DEET च्या दोन सांद्रतांचा परिणाम CyQUANT सेल प्रोलिफरेशन अॅसे किट (मॉलिक्युलर प्रोब्स, C7026) वापरून विश्लेषण करण्यात आला. थोडक्यात, प्रत्येक विहिरीत 5.103 पेशी 96-वेल प्लेटमध्ये सीड केल्या गेल्या, रात्रभर जोडल्या गेल्या आणि नंतर 24 तासांसाठी DEET ने उपचार केले गेले. ग्रोथ मिडियम काढून टाकल्यानंतर, मायक्रोप्लेटच्या प्रत्येक विहिरीत डाई बाइंडिंग सोल्यूशन घाला आणि पेशींना 37 °C वर 30 मिनिटांसाठी इनक्युबेट करा. 485 nm उत्सर्जन फिल्टर आणि 530 nm उत्सर्जन फिल्टरसह सुसज्ज असलेल्या Mithras LB940 मल्टीमोड मायक्रोप्लेट रीडर (बर्थोल्ड टेक्नॉलॉजीज, बॅड वाइल्डबॅड, जर्मनी) वापरून फ्लोरोसेन्स पातळी निश्चित केली गेली.
HUVEC ला ९६-वेल प्लेट्समध्ये प्रत्येक विहिरीत १०४ पेशींच्या घनतेवर सीड केले गेले. २४ तासांसाठी DEET ने पेशींवर प्रक्रिया करण्यात आली. कलरीमेट्रिक MTT परख (सिग्मा-अल्ड्रिच, M5655) वापरून पेशी व्यवहार्यतेचे मूल्यांकन करण्यात आले. ५७० nm तरंगलांबी असलेल्या मल्टीमोड मायक्रोप्लेट रीडर (मिथ्रास LB940) वर ऑप्टिकल घनता मूल्ये प्राप्त करण्यात आली.
इन विट्रो अँजिओजेनेसिस अॅसेज वापरून DEET च्या परिणामांचा अभ्यास करण्यात आला. 10-8 M किंवा 10-5 M DEET सह उपचार केल्याने HUVECs मध्ये केशिका लांबीची निर्मिती वाढली (आकृती 1a, b, पांढऱ्या पट्ट्या). नियंत्रण गटाच्या तुलनेत, 10-14 ते 10-5 M पर्यंतच्या DEET सांद्रता असलेल्या उपचारांमध्ये असे दिसून आले की केशिका लांबी 10-8 M DEET वर एका पठारावर पोहोचली (पूरक आकृती S2). 10-8 M आणि 10-5 M च्या एकाग्रता श्रेणीमध्ये DEET सह उपचार केलेल्या HUVECs च्या इन विट्रो प्रोएंजिओजेनिक परिणामात कोणताही महत्त्वपूर्ण फरक आढळला नाही.
DEET चा निओव्हस्क्युलरायझेशनवर होणारा परिणाम निश्चित करण्यासाठी, आम्ही इन विवो निओव्हस्क्युलरायझेशन अभ्यास केला. १४ दिवसांनंतर, १०-८ M किंवा १०-५ M DEET सह प्रीकल्चर्ड एंडोथेलियल पेशींनी इंजेक्शन दिलेल्या उंदरांमध्ये हिमोग्लोबिन सामग्रीत लक्षणीय वाढ दिसून आली (आकृती १c, पांढऱ्या पट्ट्या).
शिवाय, DEET-प्रेरित नियोव्हस्कुलरायझेशनचा अभ्यास U87MG झेनोग्राफ्ट-बेअरिंग उंदरांमध्ये करण्यात आला ज्यांना दररोज (ip) DEET इंजेक्शन दिले जात असे ज्याचे प्लाझ्मा सांद्रता 10-5 M च्या डोसवर होते, जे उघड झालेल्या मानवांमध्ये सामान्य आहे. 23 मध्ये. U87MG पेशी उंदरांमध्ये इंजेक्शन दिल्यानंतर 14 दिवसांनी शोधण्यायोग्य ट्यूमर (म्हणजेच 100 mm3 पेक्षा जास्त ट्यूमर) आढळून आले. 28 व्या दिवशी, DEET-उपचारित उंदरांमध्ये नियंत्रण उंदरांच्या तुलनेत ट्यूमरची वाढ लक्षणीयरीत्या वाढली (आकृती 1d, चौरस). शिवाय, ट्यूमरच्या CD31 स्टेनिंगने दर्शविले की DEET ने केशिका क्षेत्र लक्षणीयरीत्या वाढवले परंतु मायक्रोव्हेसेल घनता वाढवली नाही. (आकृती 1e-g).
DETA-प्रेरित प्रसारात मस्करीनिक रिसेप्टर्सची भूमिका निश्चित करण्यासाठी, pFHHSiD (10-7 M, एक निवडक M3 रिसेप्टर विरोधी) च्या उपस्थितीत 10-8 M किंवा 10-5 M DETA वापरण्यात आला. HUVEC चा उपचार. pFHHSiD ने सर्व सांद्रतांवर DETA चे प्रजनन गुणधर्म पूर्णपणे अवरोधित केले (तक्ता 1).
या परिस्थितीत, आम्ही HUVEC पेशींमध्ये DEET केशिकाची लांबी वाढवेल का हे देखील तपासले. त्याचप्रमाणे, pFHHSiD ने DEET-प्रेरित केशिका लांबी (आकृती 1a, b, राखाडी पट्ट्या) लक्षणीयरीत्या रोखली. शिवाय, M3 siRNA सह असेच प्रयोग केले गेले. जरी नियंत्रण siRNA केशिका निर्मितीला चालना देण्यासाठी प्रभावी नव्हते, तरी M3 मस्करीनिक रिसेप्टरच्या सायलेन्सिंगमुळे DEET ची केशिका लांबी वाढवण्याची क्षमता संपुष्टात आली (आकृती 1a, b, काळ्या पट्ट्या).
शिवाय, १०-८ एम किंवा १०-५ एम डीईईटी-प्रेरित रक्तवहिन्यासंबंधी इन विट्रो आणि निओव्हस्क्युलरायझेशन इन विव्हो दोन्ही pFHHSiD द्वारे पूर्णपणे अवरोधित केले गेले (आकृती १c, d, वर्तुळे). हे निकाल दर्शवितात की DEET निवडक M3 रिसेप्टर विरोधी किंवा M3 siRNA ला संवेदनशील मार्गाद्वारे अँजिओजेनेसिसला प्रोत्साहन देते.
AChE हे DEET चे आण्विक लक्ष्य आहे. डोनेपेझिल सारखी औषधे, जी AChE इनहिबिटर म्हणून काम करतात, इन विट्रो आणि माऊस हिंडलिंब इस्केमिया मॉडेल्समध्ये EC अँजिओजेनेसिसला उत्तेजन देऊ शकतात14. आम्ही HUVEC मध्ये AChE एन्झाइम क्रियाकलापांवर DEET च्या दोन सांद्रतांचा परिणाम तपासला. नियंत्रण परिस्थितीच्या तुलनेत DEET च्या कमी (10-8 M) आणि उच्च (10-5 M) सांद्रतांमुळे एंडोथेलियल AChE क्रियाकलाप कमी झाला (आकृती 2).
DEET च्या दोन्ही सांद्रतांनी (१०-८ M आणि १०-५ M) HUVEC वर एसिटाइलकोलिनेस्टेरेस क्रियाकलाप कमी केला. BW284c51 (१०-५ M) एसिटाइलकोलिनेस्टेरेस इनहिबिटरसाठी नियंत्रण म्हणून वापरला गेला. वाहन-उपचारित पेशींच्या तुलनेत DEET च्या दोन सांद्रतांनी उपचार केलेल्या HUVEC वर AChE क्रियाकलापाच्या टक्केवारी म्हणून निकाल व्यक्त केले जातात. मूल्ये सहा स्वतंत्र प्रयोगांच्या सरासरी ± SEM म्हणून व्यक्त केली जातात. *p < नियंत्रणाच्या तुलनेत ०.०५ (क्रस्कल-वॉलिस आणि डन मल्टिपल तुलना चाचणी).
नायट्रिक ऑक्साईड (NO) अँजिओजेनिक प्रक्रियेत सामील आहे 33, म्हणून, DEET-उत्तेजित HUVECs मध्ये NO उत्पादनाचा अभ्यास करण्यात आला. DEET-उपचारित एंडोथेलियल NO उत्पादन नियंत्रण पेशींच्या तुलनेत वाढले, परंतु केवळ 10-8 M च्या डोसवर महत्त्व प्राप्त झाले (आकृती 3c). DEET-प्रेरित NO उत्पादन नियंत्रित करणारे आण्विक बदल निश्चित करण्यासाठी, वेस्टर्न ब्लॉटिंगद्वारे eNOS अभिव्यक्ती आणि सक्रियतेचे विश्लेषण केले गेले. जरी DEET उपचाराने eNOS अभिव्यक्ती बदलली नाही, तरी eNOS फॉस्फोरायलेशन (आकृती 3d) मधील उपचार न केलेल्या पेशींच्या तुलनेत त्याच्या सक्रिय साइटवर (Ser-1177) eNOS फॉस्फोरायलेशनमध्ये लक्षणीय वाढ झाली तर त्याचे प्रतिबंधक साइट (Thr-495) कमी झाले. शिवाय, सक्रियता साइट आणि प्रतिबंधक साइटवर फॉस्फोरायलेटेड eNOS चे प्रमाण एंजाइमच्या एकूण प्रमाणात सामान्य केल्यानंतर मोजले गेले. उपचार न केलेल्या पेशींच्या तुलनेत DEET च्या प्रत्येक एकाग्रतेसह उपचार केलेल्या HUVECs मध्ये हे प्रमाण लक्षणीयरीत्या वाढले (आकृती 3d).
शेवटी, मुख्य प्रोएंजियोजेनिक घटकांपैकी एक असलेल्या VEGF च्या अभिव्यक्तीचे विश्लेषण वेस्टर्न ब्लॉटिंगद्वारे केले गेले. DEET ने VEGF अभिव्यक्ती लक्षणीयरीत्या वाढवली, तर pFHHSiD ने ही अभिव्यक्ती पूर्णपणे अवरोधित केली.
DEET चे परिणाम औषधीय नाकेबंदी आणि M3 रिसेप्टर्सच्या डाउनरेग्युलेशन दोन्हीसाठी संवेदनशील असल्याने, आम्ही DEET कॅल्शियम सिग्नलिंग वाढवू शकते या गृहीतकाची चाचणी केली. आश्चर्याची गोष्ट म्हणजे, DEET HUVEC (डेटा दर्शविला नाही) आणि HEK/M3 (आकृती 4a, b) मध्ये वापरल्या जाणाऱ्या दोन्ही सांद्रतांसाठी सायटोप्लाज्मिक कॅल्शियम वाढविण्यात अयशस्वी ठरले.
पोस्ट वेळ: डिसेंबर-३०-२०२४