कृमिनाशक औषध एन,एन-डायथिल-एम-टोलुआमाइड (डीईईटीडीईई (DEET) एसीएचई (ॲसिटिलकोलिनस्टेरेज) ला प्रतिबंधित करते आणि अतिरिक्त रक्तवाहिन्यांच्या निर्मितीमुळे त्यात संभाव्य कर्करोगजन्य गुणधर्म असल्याचे नोंदवले गेले आहे. या शोधनिबंधात, आम्ही दाखवतो की डीईईटी विशेषतः एंडोथेलियल पेशींना उत्तेजित करते, ज्यामुळे रक्तवाहिन्यांची निर्मिती (ॲन्जिओजेनेसिस) वाढते आणि परिणामी ट्यूमरची वाढ वाढते. डीईईटी पेशींच्या अशा प्रक्रिया सक्रिय करते ज्यामुळे रक्तवाहिन्यांची निर्मिती होते, ज्यात पेशींची वाढ, स्थलांतर आणि आसंजन यांचा समावेश आहे. हे एंडोथेलियल पेशींमध्ये नायट्रिक ऑक्साईड (NO) चे वाढलेले उत्पादन आणि व्हीईजीएफ (VEGF) अभिव्यक्तीशी संबंधित आहे. एम३ (M3) चे शमन केल्याने किंवा औषधीय एम३ अवरोधकांचा वापर केल्याने हे सर्व परिणाम नाहीसे झाले, यावरून असे सूचित होते की डीईईटी-प्रेरित रक्तवाहिन्यांची निर्मिती एम३-संवेदनशील आहे. एम३ रिसेप्टर्सची अतिअभिव्यक्ती असलेल्या एंडोथेलियल आणि एचईके (HEK) पेशींमधील कॅल्शियम सिग्नलिंगशी संबंधित प्रयोग, तसेच बंधन आणि डॉकिंग अभ्यास, असे दर्शवतात की डीईईटी एम३ रिसेप्टर्सचे ॲलोस्टेरिक मॉड्युलेटर म्हणून कार्य करते. शिवाय, डीईई एसीएचईला प्रतिबंधित करते, ज्यामुळे ॲसिटिलकोलिनची जैवउपलब्धता आणि एम३ रिसेप्टर्सशी त्याचे बंधन वाढते, आणि ॲलोस्टेरिक नियमनाद्वारे रक्तवाहिन्यांच्या निर्मितीस चालना देणारे परिणाम वाढतात.
स्विस उंदरांच्या महाधमनीमधून प्राथमिक एंडोथेलियल पेशी (ECs) वेगळ्या करण्यात आल्या. काढण्याची पद्धत कोबायाशी प्रोटोकॉल २६ मधून स्वीकारण्यात आली होती. चौथ्या पॅसेजपर्यंत, म्युरिन ECs चे ५% उष्णतेने निष्क्रिय केलेल्या FBS सह पूरक असलेल्या EBM-2 माध्यमात संवर्धन करण्यात आले.
HUVEC, U87MG, किंवा BF16F10 पेशींच्या प्रोलिफरेशनवर (पेशींच्या वाढीवर) DEET च्या दोन सांद्रतांचा होणारा परिणाम सायक्वांट सेल प्रोलिफरेशन एसे किट (मॉलिक्युलर प्रोब्स, C7026) वापरून विश्लेषित करण्यात आला. थोडक्यात, ९६-वेल प्लेटमध्ये प्रत्येक वेलमध्ये ५.१०³ पेशी पेरण्यात आल्या, त्यांना रात्रभर चिकटून राहू दिले आणि नंतर २४ तासांसाठी DEET ने उपचारित करण्यात आले. ग्रोथ मीडियम (वाढीचे माध्यम) काढून टाकल्यानंतर, मायक्रोप्लेटच्या प्रत्येक वेलमध्ये डाय बाइंडिंग सोल्युशन (रंगद्रव्य बंधन द्रावण) टाका आणि पेशींना ३७°C तापमानावर ३० मिनिटांसाठी इनक्युबेट करा. ४८५ एनएम एक्सायटेशन फिल्टर्स आणि ५३० एनएम एमिशन फिल्टर्सने सुसज्ज असलेल्या मिथ्रास LB940 मल्टीमोड मायक्रोप्लेट रीडर (बर्थोल्ड टेक्नॉलॉजीज, बॅड वाइल्डबॅड, जर्मनी) वापरून फ्लुरोसन्सची पातळी निश्चित करण्यात आली.
HUVEC पेशी ९६-वेल प्लेट्समध्ये प्रति वेल १०४ पेशी या घनतेने पेरण्यात आल्या. पेशींवर २४ तासांसाठी DEET ने उपचार करण्यात आले. कलरिमेट्रिक MTT अॅसे (सिग्मा-अल्ड्रिच, M5655) वापरून पेशींच्या जिवंतपणाचे मूल्यांकन करण्यात आले. ऑप्टिकल डेन्सिटीची मूल्ये ५७० nm तरंगलांबीवर मल्टीमोड मायक्रोप्लेट रीडर (मिथ्रास LB940) वर मिळवण्यात आली.
इन विट्रो अँजिओजेनेसिस चाचण्या वापरून DEET चे परिणाम अभ्यासले गेले. 10-8 M किंवा 10-5 M DEET च्या उपचाराने HUVECs मध्ये केशिका लांबीची निर्मिती वाढली (आकृती 1a, b, पांढरे बार). नियंत्रण गटाच्या तुलनेत, 10-14 ते 10-5 M पर्यंतच्या DEET सांद्रतेच्या उपचाराने असे दिसून आले की केशिका लांबी 10-8 M DEET वर स्थिर झाली (पूरक आकृती S2). 10-8 M आणि 10-5 M सांद्रता श्रेणीतील DEET ने उपचार केलेल्या HUVECs च्या इन विट्रो प्रोअँजिओजेनिक परिणामामध्ये कोणताही लक्षणीय फरक आढळला नाही.
नववाहिका निर्मितीवर DEET चा परिणाम निश्चित करण्यासाठी, आम्ही इन व्हिवो नववाहिका निर्मिती अभ्यास केले. 14 दिवसांनंतर, 10-8 M किंवा 10-5 M DEET सह पूर्व-संवर्धित केलेल्या एंडोथेलियल पेशी इंजेक्ट केलेल्या उंदरांमध्ये हिमोग्लोबिनच्या प्रमाणात लक्षणीय वाढ दिसून आली (आकृती 1c, पांढरे बार).
याव्यतिरिक्त, U87MG झेनोग्राफ्ट असलेल्या उंदरांमध्ये DEET-प्रेरित नववाहिका निर्मितीचा अभ्यास करण्यात आला, ज्यांना दररोज (ip) DEET चे इंजेक्शन अशा मात्रेत दिले गेले, ज्यामुळे प्लाझ्मामध्ये 10-5 M सांद्रता निर्माण होते, जी मानवांमध्ये सामान्य असते. 23. उंदरांमध्ये U87MG पेशींचे इंजेक्शन दिल्यानंतर 14 दिवसांनी शोधण्यायोग्य ट्यूमर (म्हणजेच ट्यूमर >100 mm3) आढळून आले. 28 व्या दिवशी, नियंत्रण उंदरांच्या तुलनेत DEET-उपचारित उंदरांमध्ये ट्यूमरची वाढ लक्षणीयरीत्या वाढली होती (आकृती 1d, चौकोन). याव्यतिरिक्त, ट्यूमरच्या CD31 स्टैनिंगने दाखवले की DEET ने केशिका क्षेत्रात लक्षणीय वाढ केली, परंतु सूक्ष्मवाहिन्यांच्या घनतेत नाही. (आकृती 1e–g).
DETA-प्रेरित प्रसारात मस्कॅरिनिक रिसेप्टर्सची भूमिका निश्चित करण्यासाठी, pFHHSiD (10-7 M, एक निवडक M3 रिसेप्टर अँटागोनिस्ट) च्या उपस्थितीत 10-8 M किंवा 10-5 M DETA वापरण्यात आले. HUVEC वर उपचार. pFHHSiD ने सर्व सांद्रतांवर DETA चे प्रसारक गुणधर्म पूर्णपणे अवरोधित केले (तक्ता 1).
या परिस्थितीत, आम्ही हे देखील तपासले की DEET मुळे HUVEC पेशींमध्ये केशिका लांबी वाढते का. त्याचप्रमाणे, pFHHSiD ने DEET-प्रेरित केशिका लांबीला लक्षणीयरीत्या रोखले (आकृती 1a, b, राखाडी पट्ट्या). याव्यतिरिक्त, M3 siRNA वापरून असेच प्रयोग केले गेले. जरी कंट्रोल siRNA केशिका निर्मितीला चालना देण्यासाठी प्रभावी ठरले नाही, तरी M3 मस्कॅरिनिक रिसेप्टरच्या सायलेन्सिंगमुळे DEET ची केशिका लांबी वाढवण्याची क्षमता नाहीशी झाली (आकृती 1a, b, काळ्या पट्ट्या).
शिवाय, pFHHSiD द्वारे 10-8 M किंवा 10-5 M DEET-प्रेरित इन विट्रो व्हॅस्क्युलरायझेशन आणि इन व्हिवो निओव्हॅस्क्युलरायझेशन पूर्णपणे अवरोधित केले गेले (आकृती 1c, d, वर्तुळे). हे परिणाम सूचित करतात की DEET निवडक M3 रिसेप्टर अँटागोनिस्ट किंवा M3 siRNA ला संवेदनशील असलेल्या मार्गाद्वारे अँजिओजेनेसिसला प्रोत्साहन देते.
AChE हे DEET चे आण्विक लक्ष्य आहे. डोनेपेझिल सारखी औषधे, जी AChE अवरोधक म्हणून काम करतात, ती इन विट्रो आणि माऊस हिंडलम्ब इस्केमिया मॉडेल्समध्ये EC अँजिओजेनेसिसला उत्तेजित करू शकतात¹⁴. आम्ही HUVEC मध्ये AChE एन्झाइम क्रियेवर DEET च्या दोन सांद्रतांचा परिणाम तपासला. नियंत्रण परिस्थितीच्या तुलनेत DEET च्या कमी (10⁻⁸ M) आणि उच्च (10⁻⁵ M) सांद्रतांनी एंडोथेलियल AChE क्रिया कमी केली (आकृती २).
DEET च्या दोन्ही सांद्रतांनी (10-8 M आणि 10-5 M) HUVEC वरील ॲसिटिलकोलिनस्टेरेजची क्रियाशीलता कमी केली. ॲसिटिलकोलिनस्टेरेज अवरोधकांसाठी BW284c51 (10-5 M) चा नियंत्रण म्हणून वापर करण्यात आला. परिणाम, वाहक-उपचारित पेशींच्या तुलनेत, DEET च्या दोन सांद्रतांनी उपचारित HUVEC वरील AChE क्रियाशीलतेची टक्केवारी म्हणून व्यक्त केले आहेत. मूल्ये सहा स्वतंत्र प्रयोगांच्या सरासरी ± SEM म्हणून व्यक्त केली आहेत. *p < 0.05 नियंत्रणाच्या तुलनेत (क्रुस्कल-वॉलिस आणि डन बहुविध तुलना चाचणी).
नायट्रिक ऑक्साईड (NO) अँजिओजेनिक प्रक्रियेत सहभागी असतो³³, म्हणून, DEET-उत्तेजित HUVECs मध्ये NO उत्पादनाचा अभ्यास करण्यात आला. नियंत्रण पेशींच्या तुलनेत DEET-उपचारित एंडोथेलियल NO उत्पादन वाढले होते, परंतु ते केवळ 10⁻⁸ M डोसवरच लक्षणीय ठरले (आकृती ३c). DEET-प्रेरित NO उत्पादनावर नियंत्रण ठेवणारे आण्विक बदल निश्चित करण्यासाठी, वेस्टर्न ब्लॉटिंगद्वारे eNOS अभिव्यक्ती आणि सक्रियतेचे विश्लेषण करण्यात आले. जरी DEET उपचाराने eNOS अभिव्यक्तीमध्ये बदल केला नाही, तरीही उपचार न केलेल्या पेशींच्या तुलनेत eNOS फॉस्फोरिलेशनमध्ये, त्याने eNOS फॉस्फोरिलेशन त्याच्या सक्रिय स्थानी (Ser-1177) लक्षणीयरीत्या वाढवले, तर त्याच्या निरोधात्मक स्थानी (Thr-495) कमी केले (आकृती ३d). याव्यतिरिक्त, फॉस्फोरिलेटेड eNOS चे प्रमाण एन्झाइमच्या एकूण प्रमाणाशी सामान्य केल्यानंतर, सक्रिय स्थानी आणि निरोधात्मक स्थानी असलेल्या फॉस्फोरिलेटेड eNOS चे गुणोत्तर मोजण्यात आले. उपचार न केलेल्या पेशींच्या तुलनेत, DEET च्या प्रत्येक सांद्रतेने उपचार केलेल्या HUVECs मध्ये हे गुणोत्तर लक्षणीयरीत्या वाढले होते (आकृती ३d).
शेवटी, मुख्य प्रोअँजिओजेनिक घटकांपैकी एक असलेल्या VEGF च्या अभिव्यक्तीचे वेस्टर्न ब्लॉटिंगद्वारे विश्लेषण करण्यात आले. DEET ने VEGF अभिव्यक्तीमध्ये लक्षणीय वाढ केली, तर pFHHSiD ने ही अभिव्यक्ती पूर्णपणे रोखली.
DEET चे परिणाम M3 रिसेप्टर्सच्या फार्माकोलॉजिकल ब्लॉकेड आणि डाउनरेग्युलेशन या दोन्हींना संवेदनशील असल्यामुळे, आम्ही DEET कॅल्शियम सिग्नलिंग वाढवू शकते या गृहितकाची चाचणी केली. आश्चर्याची गोष्ट म्हणजे, वापरलेल्या दोन्ही सांद्रतांमध्ये DEET HUVEC (माहिती दर्शविलेली नाही) आणि HEK/M3 (आकृती 4a, b) मध्ये सायटोप्लाज्मिक कॅल्शियम वाढविण्यात अयशस्वी ठरले.
पोस्ट करण्याची वेळ: ३०-डिसेंबर-२०२४
