कीटकांमधील टीआरपी चॅनेलच्या कार्यावर आणि एकत्रीकरणावर कीटकनाशकांचा परिणाम कल्पना करा.

जागतिक अन्नटंचाई दूर करण्यासाठी आणि वेक्टर-जनित मानवी रोगांचा सामना करण्यासाठी कीटकनाशके महत्त्वाची भूमिका बजावतात. तथापि, कीटकनाशकांच्या प्रतिकाराच्या वाढत्या समस्येसाठी कमी वापरल्या जाणाऱ्या लक्ष्यांना लक्ष्य करणाऱ्या नवीन संयुगांचा शोध तातडीने घेणे आवश्यक आहे. कीटकांचे क्षणिक रिसेप्टर पोटेंशियल (TRPV) चॅनेल - नानझोंग (नान) आणि निष्क्रिय (Iav) - हेटेरोलॉगस चॅनेल (नान-Iav) तयार करू शकतात आणि कीटकांमध्ये भू-उष्णता, श्रवण आणि प्रोप्रिओसेप्शन मध्यस्थी करणाऱ्या यांत्रिक संवेदी अवयवांमध्ये स्थानिकीकरण करू शकतात. काही कीटकनाशके, जसे की ऍफिडोपायरोलिडोन (AP), अज्ञात यंत्रणेद्वारे नान-Iav ला लक्ष्य करतात. AP छेदन-शोषक कीटकांविरुद्ध (हेमिप्टेरन्स) प्रभावी आहे, फिलामेंट्सच्या कार्यात व्यत्यय आणून अन्न रोखते. AP फक्त नानशी बांधू शकते, परंतु फक्त नान-Iav एगोनिस्टशी संवाद साधू शकते, ज्यामध्ये अंतर्जात निकोटीनामाइड (NAM) समाविष्ट आहे, ज्यामुळे चॅनेल क्रियाकलाप प्रदर्शित होतो. कीटकनाशक लक्ष्य म्हणून नान-Iav ची क्षमता असूनही, त्याच्या चॅनेल असेंब्ली, नियामक बंधन स्थळे आणि Ca2+-आश्रित नियमन याबद्दल फारसे माहिती नाही, ज्यामुळे पुढील कीटकनाशक विकासात अडथळा येतो. या अभ्यासात, कॅल्मोड्युलिन-लिगँड-मुक्त अवस्थेतील हेमिप्टेरा कीटकांमध्ये तसेच अँकिरिन रिपीट सायटोप्लाज्मिक डोमेन (एआरडी) च्या सीमेवर एपी आणि एनएएमसह नॅन-आयएव्हीची रचना निश्चित करण्यासाठी क्रायो-इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपीचा वापर करण्यात आला. आश्चर्याची गोष्ट म्हणजे, आम्हाला आढळले की नॅन प्रथिने स्वतः पेंटामर तयार करू शकतात, जे एपी-मध्यस्थ एआरडी परस्परसंवादाद्वारे स्थिर होते. या अभ्यासात कीटकनाशके आणि अ‍ॅगोनिस्ट आणि नॅन-आयएव्ही यांच्यातील आण्विक परस्परसंवाद उघडकीस आले आहेत, ज्यामुळे चॅनेल फंक्शन आणि असेंब्लीमध्ये एआरडीचे महत्त्व अधोरेखित झाले आहे आणि Ca2+ नियमनाची यंत्रणा एक्सप्लोर करण्यात आली आहे.
वाढत्या तीव्र जागतिक हवामान बदलाच्या पार्श्वभूमीवर, बिघडणारी जागतिक अन्न सुरक्षा ही २१ व्या शतकातील एक प्रमुख आव्हान आहे, ज्याचे समाजावर तीव्र परिणाम होत आहेत.^१,२जागतिक आरोग्य संघटनेच्या २०२३ च्या जागतिक अन्न सुरक्षा आणि पोषण स्थिती (SOFI) अहवालात असा अंदाज आहे की जगभरातील अंदाजे २.३३ अब्ज लोक मध्यम ते गंभीर अन्न असुरक्षिततेने ग्रस्त आहेत, ही एक दीर्घकालीन समस्या आहे.^३,४दुर्दैवाने, दरवर्षी अंदाजे २०% ते ३०% किंवा त्याहून अधिक पीक उत्पादन कीटक आणि रोगजनकांमुळे नष्ट होते आणि जागतिक तापमानवाढीमुळे कीटकांचा प्रतिकार आणि पिकांची असुरक्षितता वाढण्याची अपेक्षा आहे.^{४,५,६,७,८}कीटकनाशकांचा विकास केवळ पिकांना कीटकांपासून वाचवण्यासाठी आणि वेक्टर-जनित रोगजनकांचा प्रसार कमी करण्यासाठीच नाही तर डेंग्यू ताप, मलेरिया आणि चागस रोग यांसारख्या वेक्टर-जनित मानवी रोगांचा सामना करण्यासाठी देखील महत्त्वाचा आहे, जे कीटकनाशकांना वाढत्या प्रमाणात प्रतिरोधक आहेत.^{५,९,१०,११}
न्यूरोटॉक्सिक कीटकनाशकांच्या प्रमुख लक्ष्यांपैकी, हेटेरोटेट्रामेरिक टीआरपीव्ही चॅनेल नानचुंग (नान)-इनएक्टिव्ह (आयएव्ही) हे गेल्या दशकातच शोधलेल्या कीटकनाशक लक्ष्यांचा एक वर्ग आहे, ज्यामध्ये इमिडाक्लोप्रिड आणि पायराक्लोस्ट्रोबिन सारख्या व्यावसायिकरित्या उपलब्ध कीटकनाशकांचा समावेश आहे.^{१२,१३,१४}अर्ध-कृत्रिम कीटकनाशक अ‍ॅफिडोपायरोलिफेन (एपी) हे अलिकडेच विकसित आणि व्यावसायिकरित्या विकसीत केलेले उत्पादन आहे ज्याचा मुख्य घटक सक्रिय कीटकनाशक इन्स्कॅलिस® आहे, जो सबनॅनोमोलर क्रियाकलाप पातळीवर एपीला बांधतो.¹⁵एपी परागकण, फायदेशीर कीटक आणि इतर लक्ष्य नसलेल्या जीवांसाठी कमी तीव्र विषारीपणा दर्शवते आणि लेबलच्या सूचनांनुसार वापरल्यास, ते इतर कीटकनाशकांवरील प्रतिकार दाब कमी करू शकते.^{१६,१७,१८}नान आणि आयव्ह हे कीटकांच्या प्रजातींमध्ये मोठ्या प्रमाणात वितरित केले जातात, ते फक्त अँटेना आणि अवयवांच्या कॉर्डल स्ट्रेच रिसेप्टर न्यूरॉन्समध्ये सह-अभिव्यक्त होतात आणि श्रवण, गुरुत्वाकर्षण धारणा आणि प्रोप्रियोसेप्शनसाठी महत्त्वपूर्ण असतात.^{१३,१६,१९,२०,२१,२२}एपी, इमिडाक्लोप्रिड आणि पायराक्लोस्ट्रोबिन एका अद्वितीय यंत्रणेद्वारे नॅन-आयएव्ही कॉम्प्लेक्सला उत्तेजित करतात, शेवटी प्रोप्रियोसेप्टिव्ह सिग्नल ट्रान्सडक्शनला प्रतिबंधित करतात.^{१३,१६,२३}मावा आणि पांढऱ्या माश्यांसारख्या छेदन करणाऱ्या कीटकांमध्ये (हेमिप्टेरन्स) प्रोप्रिओसेप्शन कमी झाल्यामुळे त्यांची खाण्याची क्षमता बिघडते आणि शेवटी मृत्यू होतो.^{१३,२४}मनोरंजक गोष्ट म्हणजे, AP मध्ये Nan-Iav कॉम्प्लेक्ससाठी जास्त आत्मीयता आहे आणि फक्त Nan साठी कमी आत्मीयता आहे. AP चे Nan-Iav ला बांधणी केल्याने विद्युत प्रवाह निर्माण होतो, परंतु फक्त Nan ला बांधणी केल्याने चॅनेल क्रियाकलाप उत्तेजित होत नाही. Iav स्वतः AP ला अजिबात बांधत नाही.¹⁶यावरून असे सूचित होते की नॅन आणि आयएव्ही वेगवेगळे नॅन-आयएव्ही चॅनेल कॉम्प्लेक्स तयार करण्यासाठी बांधले जाऊ शकतात (उदा., वेगवेगळ्या स्टोइचियोमेट्रिक गुणोत्तरांसह किंवा समान स्टोइचियोमेट्रिक गुणोत्तरांमध्ये वेगवेगळ्या व्यवस्थांसह) किंवा एपी अनेक ठिकाणी बांधले जाऊ शकते. शिवाय, नैसर्गिक अ‍ॅगोनिस्ट निकोटीनामाइड (एनएएम) ड्रोसोफिला नॅन-आयएव्हीला मायक्रोमोलर अॅफिनिटीसह बांधतो, ज्यामुळे इन विट्रोमध्ये ऍफिड्स (एपी) सारखेच परिणाम दिसून येतात.^{१६,२५}आणि मावळ्यांचे पुनरुत्पादन आणि खाद्य रोखणे, ज्यामुळे शेवटी त्यांचा मृत्यू होतो^{२५,२६}. या डेटामुळे अनेक प्रश्न निर्माण होतात. उदाहरणार्थ, नान-आयएव्ही हेटेरोडायमर कसा तयार होतो, लहान रेणूंचे मॉड्युलेट करण्यासाठी कोणत्या बंधन स्थळांचा वापर केला जातो आणि हे लहान रेणू प्रोप्रियोसेप्शन दाबून चॅनेल फंक्शनचे नियमन कसे करतात हे अद्याप अस्पष्ट आहे. शिवाय, नान स्वतः निष्क्रिय का आहे आणि AP साठी कमी आत्मीयता का आहे, तर नान-आयएव्ही हेटेरोडायमर सक्रिय आहे आणि AP ला उच्च आत्मीयतेसह बांधतो याची कारणे अस्पष्ट आहेत. शेवटी, नान-आयएव्ही फंक्शनच्या Ca2+-आश्रित नियमनाबद्दल आणि ते न्यूरोनल सिग्नलिंग प्रक्रियेत कसे एकत्रित केले जाते याबद्दल फारसे माहिती नाही.^{१३,२१}
या अभ्यासात, क्रायो-इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी आणि रेडिओलिगँड बंधन तंत्रांचे संयोजन करून, आम्ही नॅन-आयएव्हीचे असेंब्ली आणि लहान रेणू नियामकांशी त्याचे बंधन कसे होते हे स्पष्ट केले. शिवाय, आम्हाला आयएव्ही आणि एपी-स्थिर नॅन पेंटामर्सशी घटकात्मकपणे बांधलेले कॅल्मोड्युलिन (CaM) आढळले. हे निकाल चॅनेलमधील कॅल्शियम आयनांचे नियमन, चॅनेल असेंब्ली आणि लिगँड बंधन आत्मीयता निश्चित करणारे घटक याबद्दल महत्त्वपूर्ण अंतर्दृष्टी प्रदान करतात. अधिक महत्त्वाचे म्हणजे, आम्ही पुष्टी केली की ARD या प्रक्रियांमध्ये मध्यवर्ती भूमिका बजावते. संबंधित कृषी कीटकनाशकांशी बांधलेल्या संपूर्ण कीटक चॅनेलचा आमचा अभ्यास^{२७, २८, २९}कीटकनाशक उद्योगाच्या विकासासाठी, कीटकनाशकांची कार्यक्षमता आणि विशिष्टता सुधारण्यासाठी आणि जागतिक अन्न सुरक्षा आणि वेक्टर-जनित रोगांच्या प्रसाराला तोंड देण्यासाठी TRPV-लक्ष्यित संयुगे इतर प्रजातींमध्ये वापरण्यास सक्षम करण्यासाठी संधी उघडते.
आम्हाला असेही आढळले की Nan-Iav हे Ca2+ द्वारे नियंत्रित केले जाते आणि नियमनाची यंत्रणा घटकात्मकरित्या बांधलेल्या CaM द्वारे मध्यस्थी केली जाते. महत्त्वाचे म्हणजे, CaM द्वारे Nav चे हे Ca2+-आश्रित नियमन इतर आयन चॅनेलच्या नियमनाच्या यंत्रणेपेक्षा लक्षणीयरीत्या वेगळे आहे (उदा., व्होल्टेज-गेटेड Na+ चॅनेल आणि TRPV5/6 चॅनेल).^{५२,५३,५४,५५,५६,५७}. Nav1.2 चॅनेलमध्ये, CaM चे C-टर्मिनल डोमेन हेलिकली C-टर्मिनल डोमेन (CTD) शी जोडले जाते आणि Ca2+ त्याच्या N-टर्मिनल डोमेनला CTD च्या दूरच्या भागात बंधनकारक करते.⁵⁶. TRPV5/6 चॅनेलमध्ये, CaM चे C-टर्मिनल डोमेन CTH शी जोडले जाते आणि Ca2+ त्याच्या N-टर्मिनल डोमेनचा वरच्या दिशेने विस्तार छिद्रांमध्ये करते, ज्यामुळे कॅशन पारगम्यता अवरोधित होते.^{५३,५४}. आम्ही Nan-Iav-CaM च्या Ca2+-नियमित कार्यासाठी एक मॉडेल प्रस्तावित करतो (आकृती 4h). या मॉडेलमध्ये, CaM चे N-टर्मिनल डोमेन Iav च्या C-टर्मिनल डोमेन (CTH) शी घटकात्मकपणे बांधले जाते. विश्रांतीच्या स्थितीत (कमी [Ca2+] एकाग्रता), CaM चे C-टर्मिनल डोमेन Nan शी संवाद साधते, ARD कन्फॉर्मेशन स्थिर करते आणि त्याद्वारे चॅनेल उघडण्यास प्रोत्साहन देते. चॅनेलला अ‍ॅगोनिस्ट/कीटकनाशक बांधल्याने छिद्र उघडण्यास प्रेरित होते, ज्यामुळे Ca2+ इनफ्लक्स होतो. Ca2+ नंतर CaM शी बांधले जाते, ज्यामुळे Nan च्या ARD पासून C-टर्मिनल डोमेनचे पृथक्करण होते. CaM बंधन अवरोधित केल्याने Ca2+ चा प्रतिबंधात्मक प्रभाव मूलतः रद्द होतो, हे पृथक्करण ARD गतिशीलता नियंत्रित करते, ज्यामुळे Ca2+-आश्रित प्रतिबंध किंवा संवेदीकरण कमी होते. कॅल्शियम आयन उत्सर्जनानंतर चॅनेल प्रवाहांची जलद पुनर्प्राप्ती (आकृती 4g) सूचित करते की ही यंत्रणा Ca2+-मध्यस्थ न्यूरोनल सिग्नलना जलद प्रतिसाद सुलभ करते. शिवाय, आयएव्हीचा सी-टर्मिनल प्रदेश, जो अजूनही नीट समजलेला नाही, तो चॅनेल लक्ष्यीकरण आणि सध्याच्या नियमनात इतर भूमिका बजावत असल्याचे नोंदवले गेले आहे.21
शेवटी, आमचा अभ्यास कृषी महत्त्वाच्या कीटकनाशक-कीटकनाशक TRP चॅनेल कॉम्प्लेक्सची उच्च-रिझोल्यूशन रचना सादर करतो - ही शोध आम्हाला पूर्वी माहित नव्हता. विशेष म्हणजे, आम्ही कीटक पेशींऐवजी मानवी पेशींमध्ये (HEK293S GnTi–) कीटक चॅनेलची रचना आणि कार्य वर्णन केले. वाढत्या कीटकनाशक प्रतिकार आणि अन्न सुरक्षा आणि रोगजनकांवर सतत दबाव असताना, आमचे कार्य महत्वाची माहिती प्रदान करते जी मानवी आरोग्य आणि जागतिक अन्न सुरक्षेच्या फायद्यासाठी नवीन कीटकनाशके विकसित करण्यास मदत करेल. अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की AP सारखी कीटकनाशके लेबल सूचनांनुसार वापरल्यास काही कीटकांविरुद्ध प्रभावी असतात आणि फायदेशीर परागकणांना कमी तीव्र विषारीपणा असतो, ज्यामुळे त्यांची पर्यावरणीय सुरक्षितता दिसून येते.^{१३,१६}शिवाय, काही एपी डेरिव्हेटिव्ह्जच्या डासांवर केलेल्या चाचणीतून असे दिसून आले आहे की ते अखेरीस उडण्याची क्षमता गमावतात. हे मॉड्युलेटिंग संयुगे नान-आयएव्हीशी कसे बांधले जातात हे समजून घेतल्याने विद्यमान संयुगे सुधारणे किंवा अधिक प्रभावी आणि^अचूककीटक नियंत्रण. आमच्या अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की नॅन-आयएव्ही एआरडी इंटरफेस केवळ अंतर्जात संयुगे, कीटकनाशके आणि Ca2+-CaM च्या क्रियाकलापांचे नियमन करण्यासाठीच नाही तर चॅनेल असेंब्लीसाठी देखील महत्त्वपूर्ण आहे. आम्ही असे सुचवितो की लहान रेणूंसह हेटेरोडायमर असेंब्लीमध्ये व्यत्यय आणणे हा आयन चॅनेल इनहिबिटर विकसित करण्यासाठी एक अद्वितीय आणि आशादायक दृष्टिकोन असू शकतो.
आठ ऑर्थोलॉगस जनुकांपैकी, तपकिरी बीटल (हॅलिओमॉर्फा हॅलिस) नानचुंग आणि इनएक्टिव्हचे पूर्ण-लांबीचे जनुक निवडले गेले, जे डिटर्जंटमध्ये उत्कृष्ट स्थिरता दर्शवितात. संश्लेषित जनुकांना मानवी अभिव्यक्तीसाठी कोडॉन-ऑप्टिमाइझ केले गेले आणि XhoI आणि EcoRI प्रतिबंध साइट्स वापरून pBacMam pCMV-DEST वेक्टर (लाइफ टेक्नॉलॉजीज) मध्ये क्लोन केले गेले. यामुळे क्लोन C-टर्मिनल GFP-FLAG-10xHis आणि mCherry-FLAG-10xHis टॅग्जसह फ्रेममध्ये असल्याचे सुनिश्चित झाले, जे HRC-3C प्रोटीज (PPX) द्वारे क्लीव्ह केले जातात, ज्यामुळे स्वतंत्रपणे^{अभिव्यक्ती}. pBacMam वेक्टरमध्ये नानचुंग आणि इनएक्टिव्ह क्लोन करण्यासाठी वापरलेले प्रायमर खालीलप्रमाणे होते:
K3 कॅमेरा आणि गॅटन बायोक्वांटम एनर्जी फिल्टरने सुसज्ज असलेल्या टायटन क्रिओस G2 ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोप (FEI) वर वैयक्तिक कणांच्या सूक्ष्म प्रतिमा मिळवण्यात आल्या. मायक्रोस्कोप 300 keV वर चालवला गेला, त्याची ऊर्जा सेटिंग 20 eV, नमुना पिक्सेल आकार 1.08 Å/पिक्सेल (81,000x चे नाममात्र मोठेीकरण) आणि -0.8 ते -2.2 μm पर्यंतचा डिफोकस ग्रेडियंट होता. अक्षांश S मायक्रोस्कोप (गॅटन) वापरून 25 e–px−1 s−1 च्या नाममात्र डोस दरासह, 2.4 s चा एक्सपोजर वेळ आणि एकूण डोस अंदाजे 60 e–Å−2 सह 40 फ्रेम्स प्रति सेकंद या वेगाने व्हिडिओ रेकॉर्डिंग करण्यात आले.
RELION 4.061 मध्ये MotionCor2 वापरून फिल्मवर बीम-प्रेरित गती सुधारणा आणि डोस वेटिंग करण्यात आले. पॅच-आधारित CTF अंदाज पद्धत62 वापरून क्रायोस्पार्कमध्ये कॉन्ट्रास्ट ट्रान्सफर फंक्शन (CTF) पॅरामीटर अंदाज करण्यात आला. CTF फिटिंग रिझोल्यूशन ≥4 Å असलेले फोटोमायक्रोग्राफ नंतरच्या विश्लेषणातून वगळण्यात आले. सामान्यतः, क्रायोस्पार्कमध्ये पॉइंट निवडीसाठी 500-1000 फोटोमायक्रोग्राफचा उपसंच वापरला गेला, त्यानंतर टेम्पलेट-आधारित कण निवडीसाठी स्पष्ट संदर्भ प्रतिमा मिळविण्यासाठी फिल्टरिंगनंतर 2D वर्गीकरणाच्या अनेक फेऱ्या केल्या गेल्या. त्यानंतर 64-पिक्सेल बाउंडिंग बॉक्स आणि 4-फोल्ड बिनिंग वापरून कण काढले गेले. अवांछित कण श्रेणी काढून टाकण्यासाठी 2D वर्गीकरणाच्या अनेक फेऱ्या करण्यात आल्या. सुरुवातीचे 3D मॉडेल ab initio पुनर्रचना वापरून पुनर्बांधणी करण्यात आले आणि cryoSPARC मध्ये नॉन-युनिफॉर्म रिफायनमेंट वापरून परिष्कृत केले गेले. ARD विषमतेवर आधारित क्रायोस्पार्क किंवा RELION मध्ये 3D वर्गीकरण करण्यात आले. मेम्ब्रेन डोमेनची कोणतीही महत्त्वपूर्ण विषमता आढळली नाही. C1 आणि C2 पद्धती वापरून कणांचे परिष्करण करण्यात आले; C2 च्या तुलनेत जास्त C2 रिझोल्यूशन असलेले कण सममित मानले गेले आणि बायेशियन रिफाइनमेंटसाठी RELION मध्ये आयात केले गेले. नंतर अंतिम नॉन-युनिफॉर्म आणि स्थानिक रिफाइनमेंटसाठी कण परत क्रायोस्पार्कमध्ये हस्तांतरित केले गेले. अंतिम रिझोल्यूशन आणि कण संख्या तक्ता 1 मध्ये दर्शविल्या आहेत.
Nan+AP पेंटामर्सवर प्रक्रिया करताना, आम्ही मेम्ब्रेन डोमेनचे (विशेषतः पोर प्रदेशाचे) रिझोल्यूशन सुधारण्यासाठी विविध पद्धतींचा शोध घेतला, जसे की सिग्नल वजाबाकी आणि TMD मास्किंग. तथापि, पोर प्रदेशातील संभाव्य अतिरेकी विकार आणि TMD च्या एकूण विषमतेमुळे हे प्रयत्न अयशस्वी झाले. अंतिम रिझोल्यूशनची गणना क्रायोस्पार्कमधील नॉन-युनिफॉर्म प्रोसेसिंग पद्धतीद्वारे स्वयंचलितपणे तयार केलेल्या मास्कचा वापर करून करण्यात आली, जे प्रामुख्याने ARD प्रदेशाला लक्ष्य करते. यामुळे मेम्ब्रेन डोमेनच्या (विशेषतः VSLD प्रदेश) पेक्षा लक्षणीयरीत्या जास्त रिझोल्यूशन प्राप्त झाले.
नानचुंग आणि इनएक्टिव्ह बग्सच्या अपो फॉर्मचे प्रारंभिक डी नोव्हो मॉडेल्स प्रथम Coot63 वापरून तयार केले गेले आणि कमी-विश्वास क्षेत्रे ओळखण्यासाठी नान आणि आयएव्ही बग्सचे मॉडेल्स अल्फाफोल्ड264 वापरून तयार केले गेले. कॅल्मोड्युलिन मॉडेलिंग अनुक्रमे PDB अॅक्सेसियन्स 4JPZ56 आणि 1CFD65 मधील Ca2+-बाइंडिंग आणि Ca2+-फ्री मॉडेल्सच्या कठोर-बॉडी फिट्सवर आधारित होते. योग्य स्टीरिओकेमिस्ट्री आणि चांगली भूमिती सुनिश्चित करण्यासाठी गोलाकार परिष्करण वापरून मॉडेल्स सुधारित केले गेले. नंतर फॉस्फेटिडायलकोलीन, फॉस्फेटिडायलेथेनोलामाइन आणि फॉस्फेटिडायलसेरिनचे सु-परिभाषित लिपिड घनता म्हणून मॉडेलिंग केले गेले आणि NAM आणि AP लिगँड्स घट्ट जंक्शनमध्ये संबंधित घनतेमध्ये ठेवण्यात आले. PHENIX66 मध्ये eLBOW वापरून आयसोफॉर्म्सच्या SMILES स्ट्रिंगमधून प्रतिबंध फायली तयार केल्या गेल्या. शेवटी, स्थानिक ग्रिड शोध आणि दुय्यम संरचना मर्यादांसह जागतिक मिनिमायझेशन वापरून PHENIX मध्ये मॉडेल्स वास्तविक जागेत सुधारित केले गेले. मॉडेल रिफाइनमेंट आणि स्ट्रक्चरल विश्लेषणासाठी MolProbity सर्व्हरचा वापर करण्यात आला आणि PyMOL आणि UCSF Chimera X वापरून चित्रे सादर करण्यात आली. 67,68,69 HOLE सर्व्हर वापरून एपर्चर विश्लेषण करण्यात आले,70 आणि Consurf सर्व्हर वापरून अनुक्रम संवर्धन मॅपिंग करण्यात आले.71
इगोर प्रो ६.२, एक्सेल ऑफिस ३६५ आणि ग्राफपॅड प्रिझम ७.० वापरून सांख्यिकीय विश्लेषण करण्यात आले. सर्व परिमाणात्मक डेटा सरासरी ± मानक त्रुटी (SEM) म्हणून सादर केला आहे. दोन गटांची तुलना करण्यासाठी विद्यार्थ्यांची टी-टेस्ट (टू-टेल, अनपेअर) वापरली गेली. अनेक गटांची तुलना करण्यासाठी डनेटची पोस्ट हॉक चाचणी आणि त्यानंतर भिन्नतेचे एकतर्फी विश्लेषण (ANOVA) वापरले गेले. *P< ०.०५, **पी< ०.०१, आणि ***Pडेटा वितरणावर अवलंबून < ०.००१ सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण मानले गेले. Kd, Ki मूल्ये आणि त्यांचे असममित ९५% आत्मविश्वास मध्यांतर ग्राफपॅड प्रिझम १० वापरून मोजले गेले.
अभ्यास पद्धतीबद्दल अधिक माहितीसाठी, कृपया या लेखात लिंक केलेला नेचर पोर्टफोलिओ रिपोर्ट सारांश पहा.
सुरुवातीचे मॉडेल PDB 4JPZ आणि 1CFD डेटाबेसमधील कॅल्मोड्युलिन मॉडेल्स वापरून तयार करण्यात आले होते. प्रोटीन डेटा बँक (PDB) मध्ये 9NVN (लिगँडशिवाय Nan-Iav-CaM), 9NVO (निकोटीनामाइडशी बांधलेले Nan-Iav-CaM), 9NVP (निकोटीनामाइड आणि EDTA ला बांधलेले Nan-Iav-CaM), 9NVQ (निकोटीनामाइड आणि EDTA ला बांधलेले Nan-Iav-CaM), 9NVR (निकोटीनामाइड आणि EDTA ला बांधलेले Nan-Iav-CaM), आणि 9NVS (निकोटीनामाइड आणि EDTA ला बांधलेले Nan-Iav-CaM) या अॅक्सेसन क्रमांकांखाली निर्देशांक जमा केले आहेत. संबंधित क्रायो-इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी प्रतिमा इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी डेटाबेस (EMDB) मध्ये खालील अॅक्सेसन क्रमांकांखाली जमा केल्या जातात: EMD-49844 (लिगँडशिवाय Nan-Iav-CaM), EMD-49845 (निकोटीनामाइडसह Nan-Iav-CaM कॉम्प्लेक्स), EMD-49846 (निकोटीनामाइड आणि EDTA सह Nan-Iav-CaM कॉम्प्लेक्स), EMD-49847 (अ‍ॅफिडोपायरोलीन आणि कॅल्शियमसह Nan-Iav-CaM कॉम्प्लेक्स), EMD-49848 (अ‍ॅफिडोपायरोलीन आणि EDTA सह Nan-Iav-CaM कॉम्प्लेक्स), आणि EMD-49849 (अ‍ॅफिडोपायरोलीनसह Nan पेंटामर कॉम्प्लेक्स). कार्यात्मक विश्लेषणासाठी कच्चा डेटा या पेपरमध्ये सादर केला आहे.