जागतिक अन्नटंचाईवर मात करण्यासाठी आणि कीटकजन्य मानवी रोगांचा सामना करण्यासाठी कीटकनाशके महत्त्वपूर्ण भूमिका बजावतात. तथापि, कीटकनाशक प्रतिकारशक्तीच्या वाढत्या समस्येमुळे, कमी वापरल्या गेलेल्या लक्ष्यांना लक्ष्य करणाऱ्या नवीन संयुगांच्या शोधाची तातडीने गरज आहे. कीटकांचे ट्रान्झिएंट रिसेप्टर पोटेन्शियल (TRPV) चॅनेल्स—नानझोंग (Nan) आणि निष्क्रिय (Iav)—हेटेरोलॉगस चॅनेल्स (Nan-Iav) तयार करू शकतात आणि कीटकांमध्ये भूगुरुत्वाकर्षण, श्रवण आणि स्व-संवेदना यांसारख्या क्रिया करणाऱ्या यांत्रिक-संवेदी अवयवांमध्ये स्थिरावू शकतात. ॲफिडोपिरोलिडोन (AP) सारखी काही कीटकनाशके, अज्ञात यंत्रणेद्वारे Nan-Iav ला लक्ष्य करतात. AP हे टोचून-शोषणाऱ्या कीटकांविरुद्ध (हेमिप्टेरन्स) प्रभावी आहे, जे तंतूंच्या कार्यात व्यत्यय आणून त्यांना खाण्यापासून प्रतिबंधित करते. AP फक्त Nan शीच बांधले जाऊ शकते, परंतु केवळ Nan-Iav हेच अंतर्जात निकोटिनामाइड (NAM) सह ॲगोनिस्ट्सशी संवाद साधू शकते, ज्यामुळे चॅनेल क्रियाशीलता दिसून येते. कीटकनाशक लक्ष्य म्हणून नॅन-आयएव्हीची क्षमता असूनही, त्याच्या चॅनल असेंब्ली, नियामक बंधन स्थळे आणि Ca2+-अवलंबित नियमनाबद्दल फार कमी माहिती उपलब्ध आहे, ज्यामुळे पुढील कीटकनाशक विकासात अडथळा येतो. या अभ्यासात, हेमिप्टेरा कीटकांमध्ये कॅल्मोड्युलिन-लिगँड-मुक्त अवस्थेत, तसेच अँकिरिन रिपीट सायटोप्लाज्मिक डोमेन (ARD) च्या सीमेवर AP आणि NAM सह नॅन-आयएव्हीची रचना निश्चित करण्यासाठी क्रायो-इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपीचा वापर करण्यात आला. आश्चर्याची गोष्ट म्हणजे, आम्हाला आढळले की नॅन प्रथिन स्वतःच एक पेंटामर तयार करू शकते, जे AP-मध्यस्थ ARD आंतरक्रियांद्वारे स्थिर होते. हा अभ्यास कीटकनाशके आणि ॲगोनिस्ट्स व नॅन-आयएव्ही यांच्यातील आण्विक आंतरक्रिया उघड करतो, चॅनलच्या कार्यात आणि असेंब्लीमध्ये ARD चे महत्त्व अधोरेखित करतो आणि Ca2+ नियमनाच्या यंत्रणेचा शोध घेतो.
वाढत्या गंभीर जागतिक हवामान बदलाच्या पार्श्वभूमीवर, ढासळणारी जागतिक अन्नसुरक्षा हे २१ व्या शतकातील प्रमुख आव्हानांपैकी एक असून, त्याचे समाजावर दूरगामी परिणाम होत आहेत.१,२जागतिक आरोग्य संघटनेच्या 'स्टेट ऑफ फूड सिक्युरिटी अँड न्यूट्रिशन इन द वर्ल्ड २०२३' (SOFI) अहवालानुसार, जगभरातील अंदाजे २.३३ अब्ज लोक मध्यम ते तीव्र अन्न असुरक्षिततेने ग्रस्त आहेत, जी एक दीर्घकाळ चालणारी समस्या आहे.३,४दुर्दैवाने, कीड आणि रोगजंतूंमुळे दरवर्षी अंदाजे २०% ते ३०% किंवा त्याहून अधिक पीक उत्पादनाचे नुकसान होते आणि जागतिक तापमानवाढीमुळे कीड प्रतिकारशक्ती व पिकांची असुरक्षितता अधिकच वाढण्याची शक्यता आहे.४,५,६,७,८कीटकनाशकांचा विकास केवळ पिकांना कीटकांपासून वाचवण्यासाठी आणि कीटकवाहक रोगजंतूंचा प्रसार कमी करण्यासाठीच नव्हे, तर डेंग्यू ताप, मलेरिया आणि चागास रोग यांसारख्या कीटकवाहक मानवी रोगांचा सामना करण्यासाठीही महत्त्वाचा आहे, कारण हे रोग कीटकनाशकांना अधिकाधिक प्रतिरोधक बनत आहेत.५,९,१०,११
न्यूरोटॉक्सिक कीटकनाशकांच्या प्रमुख लक्ष्यांपैकी, हेटेरोटेट्रामेरिक TRPV चॅनेल नानचुंग (Nan)-इनऍक्टिव्ह (Iav) हे कीटकनाशक लक्ष्यांच्या एका वर्गाचे प्रतिनिधित्व करते जे केवळ गेल्या दशकात शोधले गेले आहे, ज्यामध्ये इमिडाक्लोप्रिड आणि पायराक्लोस्ट्रोबिन सारख्या व्यावसायिकरित्या उपलब्ध कीटकनाशकांचा समावेश आहे.१२, १३, १४अर्ध-कृत्रिम कीटकनाशक ॲफिडोपिरोलिफेन (AP) हे अलीकडेच विकसित आणि व्यापारीकरण केलेले उत्पादन आहे, ज्याचा मुख्य घटक सक्रिय कीटकनाशक इन्स्केलिस® आहे, जे AP ला सबनॅनोमोलर क्रियाशीलतेच्या पातळीवर बांधून ठेवते.15AP परागकण वाहक, उपयुक्त कीटक आणि इतर लक्ष्य नसलेल्या जीवांवर कमी तीव्र विषारीपणा दाखवते आणि लेबलवरील सूचनांनुसार वापरल्यास, ते इतर कीटकनाशकांवरील प्रतिकाराचा दबाव कमी करू शकते.१६, १७, १८Nan आणि Iav हे कीटकांच्या प्रजातींमध्ये सर्वत्र आढळतात, ते फक्त अँटेना आणि अवयवांच्या कॉर्डल स्ट्रेच रिसेप्टर न्यूरॉन्समध्ये एकत्रितपणे व्यक्त होतात आणि श्रवण, गुरुत्वाकर्षणाची जाणीव आणि प्रोप्रियोसेप्शनसाठी महत्त्वपूर्ण आहेत.१३, १६, १९, २०, २१, २२AP, इमिडाक्लोप्रिड आणि पायराक्लोस्ट्रोबिन एका विशिष्ट यंत्रणेद्वारे Nan-Iav कॉम्प्लेक्सला उत्तेजित करतात, ज्यामुळे अंतिमतः प्रोप्रियोसेप्टिव्ह सिग्नल ट्रान्सडक्शनला प्रतिबंध होतो.१३, १६, २३मावा आणि पांढरी माशी यांसारख्या टोचून-शोषणाऱ्या कीटकांमध्ये (हेमिप्टेरन), शरीराच्या स्थितीची जाणीव गमावल्यामुळे त्यांची अन्न खाण्याची क्षमता कमी होते, ज्यामुळे अखेरीस त्यांचा मृत्यू होतो.१३,२४विशेष म्हणजे, AP हे Nan-Iav कॉम्प्लेक्ससाठी उच्च आणि केवळ Nan साठी कमी आकर्षण दाखवते. AP चे Nan-Iav शी बंधन झाल्याने विद्युत प्रवाह निर्माण होतो, परंतु केवळ Nan शी बंधन झाल्याने चॅनलच्या कार्याला चालना मिळत नाही. Iav स्वतः AP शी अजिबात बंधन पावत नाही.16यावरून असे सूचित होते की, Nan आणि Iav एकत्र येऊन वेगवेगळे Nan-Iav चॅनल कॉम्प्लेक्स (उदा., वेगवेगळ्या स्टॉइकियोमेट्रिक गुणोत्तरांसह किंवा एकाच स्टॉइकियोमेट्रिक गुणोत्तरामध्ये वेगवेगळ्या मांडणीसह) तयार करू शकतात किंवा AP अनेक स्थळांवर बांधला जाऊ शकतो. शिवाय, नैसर्गिक ॲगोनिस्ट निकोटिनामाइड (NAM) मायक्रोमोलर आत्मीयतेने ड्रोसोफिला Nan-Iav ला बांधला जातो आणि इन विट्रोमध्ये ॲफिड्स (AP) सारखेच परिणाम दर्शवतो.१६,२५आणि माव्यांच्या प्रजननात व खाण्यात अडथळा आणून, अंतिमतः त्यांच्या मृत्यूला कारणीभूत ठरते.२५, २६या माहितीमुळे अनेक प्रश्न निर्माण होतात. उदाहरणार्थ, Nan-Iav हेटेरोडायमर कसा तयार होतो, लहान रेणूंचे नियमन करण्यासाठी कोणत्या बंधन स्थळांचा वापर केला जातो आणि हे लहान रेणू प्रोप्रियोसेप्शन दाबून चॅनलच्या कार्याचे नियमन कसे करतात, हे अद्याप अस्पष्ट आहे. शिवाय, Nan स्वतः निष्क्रिय का असतो आणि AP साठी त्याची आसक्ती कमी का असते, तर Nan-Iav हेटेरोडायमर सक्रिय असतो आणि AP ला अधिक आसक्तीने का बांधतो, याची कारणे अस्पष्ट आहेत. शेवटी, Nan-Iav कार्याचे Ca2+-अवलंबित नियमन आणि ते न्यूरॉनल सिग्नलिंग प्रक्रियांमध्ये कसे समाकलित होते, याबद्दल फारच कमी माहिती आहे.१३,२१
या अभ्यासात, क्रायो-इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी आणि रेडिओलिगँड बाइंडिंग तंत्रांचा वापर करून, आम्ही Nan-Iav ची जुळणी आणि लहान रेणू नियामकांशी त्याच्या बंधनाची यंत्रणा स्पष्ट केली. याव्यतिरिक्त, आम्ही Iav आणि AP-स्थिर Nan पेंटामर्सशी सातत्याने बांधलेले कॅल्मोड्युलिन (CaM) शोधले. हे परिणाम चॅनेलमधील कॅल्शियम आयनांचे नियमन, चॅनेलची जुळणी आणि लिगँड बंधन आसक्ती निश्चित करणाऱ्या घटकांविषयी महत्त्वपूर्ण अंतर्दृष्टी प्रदान करतात. सर्वात महत्त्वाचे म्हणजे, आम्ही पुष्टी केली की या प्रक्रियांमध्ये ARD एक मध्यवर्ती भूमिका बजावते. संबंधित कृषी कीटकनाशकांशी बांधलेल्या संपूर्ण कीटक चॅनेलचा आमचा अभ्यास.२७, २८, २९यामुळे कीटकनाशक उद्योगाच्या विकासाच्या संधी निर्माण होतात, कीटकनाशकांची परिणामकारकता आणि विशिष्टता सुधारते, तसेच जागतिक अन्न सुरक्षा आणि कीटकजन्य रोगांचा प्रसार रोखण्यासाठी TRPV-लक्ष्यित संयुगांचा इतर प्रजातींवर वापर करणे शक्य होते.
आम्हाला असेही आढळले की Nan-Iav चे नियमन Ca2+ द्वारे होते, आणि नियमनाची यंत्रणा सातत्याने बांधलेल्या CaM द्वारे मध्यस्थ केली जाते. महत्त्वाचे म्हणजे, CaM द्वारे Nav चे हे Ca2+-अवलंबित नियमन इतर आयन चॅनेलच्या (उदा., व्होल्टेज-गेटेड Na+ चॅनेल आणि TRPV5/6 चॅनेल) नियमनाच्या यंत्रणांपेक्षा लक्षणीयरीत्या वेगळे आहे.५२, ५३, ५४, ५५, ५६, ५७Nav1.2 चॅनेलमध्ये, CaM चा C-टर्मिनल डोमेन हा C-टर्मिनल डोमेन (CTD) सोबत सर्पिलाकार पद्धतीने जोडला जातो आणि Ca2+ त्याच्या N-टर्मिनल डोमेनला CTD च्या दूरच्या भागाशी जोडण्यास प्रवृत्त करतो.56TRPV5/6 चॅनेलमध्ये, CaM चा C-टर्मिनल डोमेन CTH शी जोडला जातो आणि Ca2+ त्याच्या N-टर्मिनल डोमेनला छिद्रामध्ये वरच्या दिशेने विस्तारण्यास प्रवृत्त करतो, ज्यामुळे कॅटायन पारगम्यता अवरुद्ध होते.५३,५४आम्ही Nan-Iav-CaM च्या Ca2+-नियंत्रित कार्यासाठी एक मॉडेल प्रस्तावित करतो (आकृती 4h). या मॉडेलनुसार, CaM चा N-टर्मिनल डोमेन Iav च्या C-टर्मिनल डोमेनला (CTH) सातत्याने जोडलेला असतो. विश्रांतीच्या स्थितीत (कमी [Ca2+] सांद्रता), CaM चा C-टर्मिनल डोमेन Nan सोबत आंतरक्रिया करतो, ARD संरचनेला स्थिर करतो आणि त्यामुळे चॅनल उघडण्यास प्रोत्साहन देतो. जेव्हा एखादा ॲगोनिस्ट/कीटकनाशक चॅनलला जोडला जातो, तेव्हा छिद्र उघडले जाते, ज्यामुळे Ca2+ आत येतो. त्यानंतर Ca2+ हा CaM ला जोडला जातो, ज्यामुळे C-टर्मिनल डोमेन Nan च्या ARD पासून वेगळा होतो. CaM चे बंधन रोखल्याने Ca2+ चा प्रतिबंधात्मक प्रभाव जवळजवळ नाहीसा होत असल्यामुळे, हे वेगळे होणे ARD च्या गतिशीलतेत बदल घडवते, ज्यामुळे Ca2+-अवलंबित प्रतिबंध किंवा असंवेदनशीलता निर्माण होते. कॅल्शियम आयन बाहेर पडल्यानंतर चॅनल प्रवाहांची जलद पुनर्प्राप्ती (आकृती ४g) असे सूचित करते की ही यंत्रणा Ca2+-मध्यस्थ न्यूरॉनल संकेतांना जलद प्रतिसाद देण्यास मदत करते. याव्यतिरिक्त, Iav चा C-टर्मिनल प्रदेश, ज्याबद्दल अजूनही फारशी माहिती उपलब्ध नाही, तो चॅनल लक्ष्यीकरण आणि प्रवाह नियमनामध्ये इतर भूमिका बजावतो असे नोंदवले गेले आहे.²¹
शेवटी, आमच्या अभ्यासात कृषीदृष्ट्या महत्त्वाच्या असलेल्या एका कीटकनाशक-कीटकनाशक TRP चॅनल कॉम्प्लेक्सची उच्च-रिझोल्यूशन रचना सादर केली आहे—हा एक असा शोध आहे जो आम्हाला पूर्वी अज्ञात होता. विशेष म्हणजे, आम्ही कीटकांच्या पेशींऐवजी मानवी पेशींमध्ये (HEK293S GnTi–) या कीटक चॅनलच्या रचनेचे आणि कार्याचे वैशिष्ट्यीकरण केले. वाढता कीटकनाशक प्रतिकार आणि अन्न सुरक्षा व रोगजनकांवरील सततचा दबाव या पार्श्वभूमीवर, आमचे कार्य अशी महत्त्वपूर्ण माहिती प्रदान करते, जी मानवी आरोग्य आणि जागतिक अन्न सुरक्षेच्या फायद्यासाठी नवीन कीटकनाशकांच्या विकासाला चालना देईल. अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की, AP सारखी कीटकनाशके लेबलवरील सूचनांनुसार वापरल्यास काही कीटकांविरुद्ध प्रभावी ठरतात आणि फायदेशीर परागकणांसाठी त्यांची तीव्र विषारीता कमी असते, जे त्यांची पर्यावरणीय सुरक्षितता दर्शवते.१३, १६शिवाय, डासांवर काही एपी डेरिव्हेटिव्ह्जच्या चाचणीतून असे दिसून आले आहे की ते कालांतराने उडण्याची क्षमता गमावतात. हे मॉड्युलेटिंग संयुगे Nan-Iav शी कसे जोडले जातात हे समजून घेतल्यास, अधिक प्रभावी आणि नवीन संयुगांसाठी विद्यमान संयुगांमध्ये बदल करणे किंवा नवीन संयुगे विकसित करणे सोपे होईल.अचूककीड नियंत्रण. आमच्या अभ्यासातून असे दिसून येते की, Nan-Iav ARD इंटरफेस केवळ अंतर्जात संयुगे, कीटकनाशके आणि Ca2+-CaM यांच्या क्रियाकलापांचे नियमन करण्यासाठीच नव्हे, तर चॅनलच्या जुळणीसाठी देखील महत्त्वपूर्ण आहे. आम्ही असे सुचवतो की लहान रेणूंच्या साहाय्याने हेटेरोडायमरच्या जुळणीत व्यत्यय आणणे, हा आयन चॅनल अवरोधक विकसित करण्यासाठी एक अद्वितीय आणि आशादायक दृष्टिकोन असू शकतो.
आठ ऑर्थोलॉगस जनुकांमधून, ब्राऊन बीटल (Halyomorpha halys) च्या नानचुंग आणि इनॅक्टिव्ह या पूर्ण-लांबीच्या जनुकांची निवड करण्यात आली, ज्यांनी डिटर्जंटमध्ये उत्कृष्ट स्थिरता दर्शविली. संश्लेषित जनुकांना मानवी अभिव्यक्तीसाठी कोडॉन-ऑप्टिमाइझ करण्यात आले आणि XhoI व EcoRI रिस्ट्रिक्शन साइट्स वापरून pBacMam pCMV-DEST व्हेक्टरमध्ये (लाइफ टेक्नॉलॉजीज) क्लोन करण्यात आले. यामुळे हे सुनिश्चित झाले की क्लोन्स C-टर्मिनल GFP-FLAG-10xHis आणि mCherry-FLAG-10xHis टॅग्ससोबत इन-फ्रेम होते, जे HRC-3C प्रोटीएज (PPX) द्वारे कापले जातात, ज्यामुळे स्वतंत्र क्रिया शक्य होते.अभिव्यक्तीpBacMam व्हेक्टरमध्ये नानचुंग आणि इनॅक्टिव्हचे क्लोनिंग करण्यासाठी वापरलेले प्रायमर्स खालीलप्रमाणे होते:
K3 कॅमेरा आणि गॅटन बायोक्वांटम एनर्जी फिल्टरने सुसज्ज असलेल्या टायटन क्रिओस G2 ट्रान्समिशन इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोप (FEI) वर वैयक्तिक कणांच्या सूक्ष्मदर्शी प्रतिमा मिळवण्यात आल्या. हा मायक्रोस्कोप 300 keV वर, 20 eV च्या ऊर्जा सेटिंगसह, 1.08 Å/पिक्सेलच्या सॅम्पल पिक्सेल आकारासह (81,000x चे नाममात्र आवर्धन), आणि -0.8 ते -2.2 μm पर्यंतच्या डिफोकस ग्रेडियंटसह चालवला गेला. लॅटिट्यूड S मायक्रोस्कोप (गॅटन) वापरून 40 फ्रेम्स प्रति सेकंद या दराने व्हिडिओ रेकॉर्डिंग केले गेले, ज्यामध्ये 25 e–px−1 s−1 चा नाममात्र डोस दर, 2.4 सेकंदांचा एक्सपोजर वेळ आणि अंदाजे 60 e–Å−2 चा एकूण डोस होता.
RELION 4.061 मध्ये MotionCor2 वापरून फिल्मवर बीम-प्रेरित गती सुधारणा आणि डोस वेटिंग करण्यात आले. पॅच-आधारित CTF अंदाज पद्धत62 वापरून क्रायोस्पार्क (cryoSPARC) मध्ये कॉन्ट्रास्ट ट्रान्सफर फंक्शन (CTF) पॅरामीटर अंदाज करण्यात आला. ≥4 Å CTF फिटिंग रिझोल्यूशन असलेले फोटोमायक्रोग्राफ पुढील विश्लेषणातून वगळण्यात आले. साधारणपणे, क्रायोस्पार्क (cryoSPARC) मध्ये पॉइंट निवडीसाठी 500-1000 फोटोमायक्रोग्राफचा एक उपसंच वापरला गेला, त्यानंतर टेम्पलेट-आधारित कण निवडीसाठी एक स्पष्ट संदर्भ प्रतिमा मिळवण्यासाठी फिल्टरिंगनंतर 2D वर्गीकरणाच्या अनेक फेऱ्या केल्या गेल्या. त्यानंतर 64-पिक्सेल बाउंडिंग बॉक्स आणि 4-फोल्ड बिनिंग वापरून कण काढण्यात आले. नको असलेल्या कण श्रेणी काढून टाकण्यासाठी 2D वर्गीकरणाच्या अनेक फेऱ्या केल्या गेल्या. क्रायोस्पार्क (cryoSPARC) मध्ये ॲब इनिशिओ रिकन्स्ट्रक्शन वापरून प्रारंभिक 3D मॉडेलची पुनर्रचना करण्यात आली आणि नॉन-युनिफॉर्म रिफायनमेंट वापरून ते परिष्कृत करण्यात आले. ARD विषमतेच्या आधारावर क्रायोस्पार्क (cryoSPARC) किंवा RELION मध्ये 3D वर्गीकरण करण्यात आले. मेम्ब्रेन डोमेन्सची कोणतीही लक्षणीय विषमता आढळून आली नाही. C1 आणि C2 पद्धती वापरून कणांचे शुद्धीकरण करण्यात आले; उच्च C2 रिझोल्यूशन असलेले कण C2 च्या संदर्भात सममित मानले गेले आणि बायेसियन शुद्धीकरणासाठी RELION मध्ये आयात केले गेले. त्यानंतर अंतिम असमान आणि स्थानिक शुद्धीकरणासाठी कण पुन्हा cryoSPARC मध्ये हस्तांतरित केले गेले. अंतिम रिझोल्यूशन आणि कणांची संख्या तक्ता १ मध्ये दर्शविली आहे.
Nan+AP पेंटामर्सवर प्रक्रिया करताना, आम्ही मेम्ब्रेन डोमेन्सचे (विशेषतः पोर प्रदेशाचे) रिझोल्यूशन सुधारण्यासाठी सिग्नल सबट्रॅक्शन आणि TMD मास्किंग यांसारख्या विविध पद्धतींचा शोध घेतला. तथापि, पोर प्रदेशातील संभाव्य अत्यंत अव्यवस्था आणि TMD च्या एकूण विषमतेमुळे हे प्रयत्न अयशस्वी ठरले. क्रायोस्पार्क (cryoSPARC) मधील नॉन-युनिफॉर्म प्रोसेसिंग पद्धतीद्वारे स्वयंचलितपणे तयार केलेल्या मास्कचा वापर करून अंतिम रिझोल्यूशनची गणना करण्यात आली, जे प्रामुख्याने ARD प्रदेशाला लक्ष्य करत होते. यामुळे मेम्ब्रेन डोमेन्सच्या (विशेषतः VSLD प्रदेशाच्या) तुलनेत लक्षणीयरीत्या उच्च रिझोल्यूशन प्राप्त झाले.
नानचुंग आणि इनॅक्टिव्ह बग्सच्या ॲपो स्वरूपांचे प्रारंभिक डी नोवो मॉडेल्स सर्वप्रथम Coot63 वापरून तयार केले गेले, आणि कमी-विश्वासार्हता असलेले प्रदेश ओळखण्यासाठी Nan आणि Iav बग्सचे मॉडेल्स AlphaFold264 वापरून तयार केले गेले. कॅल्मोड्युलिन मॉडेलिंग हे अनुक्रमे PDB ॲक्सेशन 4JPZ56 आणि 1CFD65 मधील Ca2+-बाइंडिंग आणि Ca2+-फ्री मॉडेल्सच्या रिजिड-बॉडी फिट्सवर आधारित होते. योग्य स्टीरिओकेमिस्ट्री आणि चांगली भूमिती सुनिश्चित करण्यासाठी स्फेरिकल रिफायनमेंट वापरून मॉडेल्स परिष्कृत केले गेले. त्यानंतर फॉस्फॅटिडिलकोलीन, फॉस्फॅटिडिलेथेनॉलअमाइन आणि फॉस्फॅटिडिलसेरीन यांना सु-परिभाषित लिपिड घनता म्हणून मॉडेल केले गेले, आणि NAM व AP लिगँड्सना टाइट जंक्शन्समधील संबंधित घनतेमध्ये ठेवण्यात आले. PHENIX66 मधील eLBOW वापरून आयसोफॉर्म्सच्या SMILES स्ट्रिंगमधून कन्स्ट्रेंट फाइल्स तयार केल्या गेल्या. शेवटी, PHENIX मध्ये स्थानिक ग्रिड शोध आणि दुय्यम संरचना बंधनांसह जागतिक लघुत्तमीकरण वापरून वास्तविक अवकाशात मॉडेल्स परिष्कृत केले गेले. मॉडेल परिष्करण आणि संरचनात्मक विश्लेषणासाठी MolProbity सर्व्हर वापरला गेला, आणि PyMOL व UCSF Chimera X वापरून चित्रे काढली गेली. 67,68,69 HOLE सर्व्हर वापरून छिद्र विश्लेषण केले गेले,70 आणि Consurf सर्व्हर वापरून अनुक्रम संवर्धन मॅपिंग केले गेले.71
सांख्यिकीय विश्लेषण इगोर प्रो ६.२, एक्सेल ऑफिस ३६५ आणि ग्राफपॅड प्रिझम ७.० वापरून केले गेले. सर्व संख्यात्मक माहिती सरासरी ± मानक त्रुटी (SEM) म्हणून सादर केली आहे. दोन गटांची तुलना करण्यासाठी स्टुडंट्स टी-टेस्ट (द्वि-पुच्छ, असंबंधित) वापरण्यात आली. अनेक गटांची तुलना करण्यासाठी एक-मार्गी विचलन विश्लेषण (ANOVA) आणि त्यानंतर डनेटची पोस्ट हॉक चाचणी वापरण्यात आली. *पी< ०.०५, **पी< ०.०१, आणि ***पीडेटा वितरणावर अवलंबून < 0.001 सांख्यिकीयदृष्ट्या महत्त्वपूर्ण मानले गेले. GraphPad Prism 10 वापरून Kd, Ki मूल्ये आणि त्यांचे असममित 95% विश्वासार्हता अंतराल मोजले गेले.
अभ्यासाच्या पद्धतीबद्दल अधिक तपशिलांसाठी, कृपया या लेखात जोडलेला नेचर पोर्टफोलिओ अहवाल सारांश पहा.
सुरुवातीचे मॉडेल PDB 4JPZ आणि 1CFD डेटाबेसमधील कॅल्मोड्युलिन मॉडेल्सचा वापर करून तयार केले गेले. त्याचे कोऑर्डिनेट्स प्रोटीन डेटा बँक (PDB) मध्ये 9NVN (लिगँडशिवाय Nan-Iav-CaM), 9NVO (निकोटिनमाइडला जोडलेले Nan-Iav-CaM), 9NVP (निकोटिनमाइड आणि EDTA ला जोडलेले Nan-Iav-CaM), 9NVQ (एफेनिडोलपायरोलिन आणि कॅल्शियमला जोडलेले Nan-Iav-CaM), 9NVR (एफेनिडोलपायरोलिन आणि EDTA ला जोडलेले Nan-Iav-CaM), आणि 9NVS (एफेनिडोलपायरोलिनला जोडलेले Nan पेंटामर) या ॲक्सेशन क्रमांकांखाली जमा केले आहेत. संबंधित क्रायो-इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी प्रतिमा इलेक्ट्रॉन मायक्रोस्कोपी डेटाबेस (EMDB) मध्ये खालील ॲक्सेशन क्रमांकांखाली जमा केल्या आहेत: EMD-49844 (लिगँडशिवाय Nan-Iav-CaM), EMD-49845 (निकोटिनमाइडसह Nan-Iav-CaM कॉम्प्लेक्स), EMD-49846 (निकोटिनमाइड आणि EDTA सह Nan-Iav-CaM कॉम्प्लेक्स), EMD-49847 (ॲफिडोपायरोलिन आणि कॅल्शियमसह Nan-Iav-CaM कॉम्प्लेक्स), EMD-49848 (ॲफिडोपायरोलिन आणि EDTA सह Nan-Iav-CaM कॉम्प्लेक्स), आणि EMD-49849 (ॲफिडोपायरोलिनसह Nan पेंटामर कॉम्प्लेक्स). कार्यात्मक विश्लेषणासाठीचा मूळ डेटा या शोधनिबंधात सादर केला आहे.
पोस्ट करण्याची वेळ: २८ जानेवारी २०२६
